湖北用于自動(dòng)化系統(tǒng)的96孔板形式PNGaseF去糖基化酶瑞典Genovis

經(jīng)過(guò)多年的經(jīng)驗(yàn)積累及市場(chǎng)積淀，倍篤生物已組合多條不同產(chǎn)品線，分別滿足體外診斷、organoid及干細(xì)胞、細(xì)胞基因藥物等領(lǐng)域的需求。其中，細(xì)胞基因藥物領(lǐng)域產(chǎn)品線包含SAN HQ高鹽核酸酶及M-SAN HQ中鹽核酸酶、泊洛沙姆P 188 Bio、GMP級(jí)MSC/PSC培養(yǎng)基、GMP級(jí)膠原酶、AAV滴度檢測(cè)產(chǎn)品、工藝雜質(zhì)及外源污染物殘留檢測(cè)產(chǎn)品、聚糖分析用酶、ADC偶聯(lián)技術(shù)、QED抗體對(duì)、AAV中和抗體、蛋白酶等；相關(guān)品牌有挪威ArcticZymes Technologies、德國(guó)BASF、德國(guó)Sartorius、德國(guó)Nordmark、瑞典Genovis、美國(guó)QED、中國(guó)君研生物等。西妥昔單抗的所有N-聚糖（包括Fab-聚糖）在Genovis固定化PNGase F10分鐘內(nèi)完全去除。湖北用于自動(dòng)化系統(tǒng)的96孔板形式PNGaseF去糖基化酶瑞典Genovis

FucosEXO中的酶在大腸桿菌中表達(dá)，帶有His標(biāo)簽，分子量為87 kDa和64 kDa。FucosEXO在天然條件下水解糖蛋白上的巖藻糖，在6至8的pH值范圍內(nèi)顯示出高活性，無(wú)需輔助因子或添加劑。1. 用于方法開發(fā)的靈活格式；2. 可以結(jié)合酶以提高效率；3. 適用于自動(dòng)化工作流程；4.即用型 - 只需加水即可。Genovis的FucosEXO 是 α-巖藻糖苷酶的混合物，用于在 N-和 O-糖基化蛋白或游離寡糖上有效水解 α1-2、α1-3 和 α1-4-連接的巖藻糖。人血清中 O-糖蛋白的富集：GlycOCATCH還可用于從復(fù)雜的樣品混合物（如人血清）中選擇性富集O-糖基化蛋白。簡(jiǎn)而言之，用Genovis的SialEXO處理血清并應(yīng)用于GlycOCATCH樹脂。洗滌樹脂，用8M尿素洗脫O-糖基化蛋白。用胰蛋白酶消化樣品并使用 RP-LC-MS/MS 進(jìn)行分析，并使用 Swiss Prot 數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定蛋白質(zhì)列表。O-糖基化蛋白以黃色表示。浙江用于自動(dòng)化系統(tǒng)的96孔板形式PNGaseF去糖基化酶糖生物學(xué)研究使用游離聚糖方法分析zhiliao性抗體曲妥珠單抗、Fc-融合蛋白依那西普和糖蛋白R(shí)Nase B的N-聚糖。

蛋白質(zhì)的N-糖基化特征是一個(gè)關(guān)鍵的質(zhì)量屬性。它會(huì)影響生物制藥的安全性和有效性，因此需要在開發(fā)和生產(chǎn)過(guò)程中進(jìn)行表征和監(jiān)測(cè)。常見(jiàn)的聚糖分析工作流程是用PNGase F釋放N-聚糖，然后用熒光標(biāo)記物（如2-AB、2-AA、普魯卡因胺或RapiFluor-MS?（沃特世公司））標(biāo)記生成的聚糖。然后使用HILIC-HPLC或毛細(xì)管電泳分離標(biāo)記的聚糖，以表征和定量不同的聚糖結(jié)構(gòu)。 在這里，使用游離聚糖方法分析zhiliao性抗體曲妥珠單抗、Fc-融合蛋白依那西普和糖蛋白R(shí)Nase B的N-聚糖。曲妥珠單抗和依那西普在天然條件下在37°C下用Genvois的PNGase F去糖基化1小時(shí)，而RNase B需要變性和還原才能完全去糖基化。因此，在50°C下用PNGase F去糖基化10分鐘之前，用RapiGest? SF表面活性劑（沃特世公司）和TCEP處理RNase B。 用RapiFluor-MS標(biāo)記所得游離的聚糖，并通過(guò)HILIC UPLC-FLD-MS進(jìn)行分析。

Genovis的SialEXO Immobilized是一種微離心柱，用于在室溫下孵育30分鐘后完全去除0.5mg天然糖蛋白上的唾液酸。為了研究依那西普的潛在電荷變體，開發(fā)了一種使用SialEXO固定化柱對(duì)糖蛋白進(jìn)行去唾液酸化的一般工作流程。毛細(xì)管電泳通常用于在生物制劑的表征和質(zhì)量控制過(guò)程中確定電荷變體。使用SialEXO Imfixedized對(duì)糖蛋白進(jìn)行去唾液酸化，并使用ProteinSimple的Maurice在成像等電聚焦中進(jìn)行分析。綜合起來(lái)，該分析工作流程改進(jìn)了糖蛋白的分離并實(shí)現(xiàn)了電荷異構(gòu)體分析。依那西普，如果不首先去除唾液酸，將很難分析，但使用SialEXO固定化分離峰可以獲得。SialEXO、FabRICATOR消化去糖基化蛋白，通過(guò)中級(jí)質(zhì)譜測(cè)定完整質(zhì)量數(shù)。

當(dāng)在完整狀態(tài)下進(jìn)行分析時(shí)，EPO的聚糖異質(zhì)性導(dǎo)致了非常復(fù)雜的質(zhì)譜圖。通過(guò)在 37°C 下在 OmniGLYZOR Microspin 柱上孵育 1 小時(shí)，可以有效地去除 N 糖（含有PNGase F酶）和 O-糖，如對(duì)應(yīng)于未修飾蛋白質(zhì)的單個(gè)峰所示。EPO上殘留了少量用乙?；僖核嵝揎椀腛-聚糖，因?yàn)镺mniGLYZOR對(duì)這種結(jié)構(gòu)的水解效率低下。根據(jù)制造商Genvois的建議（在37°C下進(jìn)行O/N孵育），兩種底物蛋白也用另一種市售的去糖基化產(chǎn)物處理，并顯示數(shù)據(jù)以供比較。另一方面，N-聚糖在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中翻譯地連接到未折疊的蛋白質(zhì)上。這導(dǎo)致某些 N-糖基化位點(diǎn)難以被 Genovis的PNGase F 接近，或者一旦底物蛋白折疊成其天然狀態(tài)，就根本無(wú)法接近。因此，這種N-聚糖的水解需要底物蛋白以與酶活性相容的方式變性。使用OpeRATOR圖譜O-聚糖位點(diǎn)對(duì)依那西普進(jìn)行LC-MS分析。浙江用于自動(dòng)化系統(tǒng)的96孔板形式PNGaseF去糖基化酶糖生物學(xué)研究

OglyZOR 是一種內(nèi)切糖苷酶，可特異性水解天然糖蛋白上的he心 1 O-聚糖；湖北用于自動(dòng)化系統(tǒng)的96孔板形式PNGaseF去糖基化酶瑞典Genovis

Genovis的ImpaRATOR? 可用于多種 O-聚糖：依那西普是一種融合蛋白，由TNF受體的胞外結(jié)構(gòu)域與人IgG1的Fc部分相連。該蛋白質(zhì)在Fc區(qū)域上方含有多達(dá)13個(gè)O-糖基化的Ser/Thr殘基簇，使其成為一種非常難以在結(jié)構(gòu)上表征的生物制藥。為了證明ImpaRATOR的聚糖特異性，制備了三種具有不同聚糖組成的依那西普樣品：（i）攜帶單唾液酸和二唾液酸化he心1結(jié)構(gòu)混合物的未經(jīng)處理的糖蛋白，（ii）用SialEXO處理的糖蛋白去除唾液酸并產(chǎn)生裸核1結(jié)構(gòu)，以及（iii）用SialEXO和GalactEXO處理的糖蛋白產(chǎn)生單個(gè)GalNAc殘基， 也稱為Tn抗原。用ImpaRATOR和FabRICATOR在一鍋反應(yīng)中處理三個(gè)樣品（圖1）。作為比較，SialEXO處理的依那西普用OpeRATOR和FabRICATOR處理。將所得肽還原、烷基化并用HILIC-MS進(jìn)行分析。FabRICATOR被包括在反應(yīng)中，以將Fc區(qū)與大多數(shù)C端糖肽分離，以促進(jìn)其表征。湖北用于自動(dòng)化系統(tǒng)的96孔板形式PNGaseF去糖基化酶瑞典Genovis