浙江PNGaseF去糖基化酶疾病機(jī)理研究

GlycOCATCH用于純化粘蛋白型O-糖基化蛋白和肽。它是基于無活性的Genovis的OpeRATOR?酶，該酶經(jīng)過工程改造，可以高親和力結(jié)合O-糖基化蛋白和肽。GlycOCATCH的應(yīng)用包括O糖蛋白和肽的特異性富集或去除、糖組學(xué)、復(fù)雜樣品的研究和生物制藥的表征。1. 粘蛋白型O-糖基化蛋白和肽的特異性富集；2. 可靠 - 高親和力結(jié)合;3. 快速且易于使用的工作流程。不需要輔助因子或特殊緩沖液。GalNAcEXO中的酶來源于Akkermansia muciniphila，在大腸桿菌中表達(dá)，帶有His標(biāo)簽，分子量為52 kDa。1. 用于方法開發(fā)的靈活格式；2. 可以結(jié)合酶以提高效率；3. 適用于自動(dòng)化工作流程； 4. 即用型 - 只需加水即可！用于水解糖蛋白上GalNAc殘基的凍干酶。Genovis的GalNAcEXO凍干劑以凍干粉末的形式提供，裝在2000單位的小瓶中，用于水解2mg糖蛋白上的GalNAc殘基。SialEXO酶來源于Akkermansia muciniphila，并在大腸桿菌中表達(dá)。浙江PNGaseF去糖基化酶疾病機(jī)理研究

對(duì)Genovis的ImpaRATOR處理的樣品的分析表明，ImpaRATOR很好地消化了所有三種底物并產(chǎn)生了相似的糖肽，但預(yù)期的聚糖種類不同。用ImpaRATOR處理的樣品比其他樣品含有更多的變異，因?yàn)槊糠N肽都檢測到多種聚糖結(jié)構(gòu)。觀察到的聚糖種類主要是單唾液酸化和二唾液酸化he心1結(jié)構(gòu)，這與依那西普的預(yù)期一致。用ImpaRATOR或OpeRATOR消化的SialEXO預(yù)處理樣品均產(chǎn)生具有裸核1結(jié)構(gòu)的肽，但攜帶在ImpaRATOR消化樣品中觀察到的Tn抗原的肽T205-P207除外。依那西普用 SialEXO 和 GalactEXO 預(yù)處理，然后用 ImpaRATOR 消化，得到含有 Tn 抗原的肽?？傊?，這些數(shù)據(jù)證明了ImpaRATOR的高聚糖底物接受度。ImpaRATOR處理的依那西普顯示出與相應(yīng)的去唾液酸化OpeRATOR處理樣品略有不同的消化模式。例如，OpeRATOR在兩個(gè)O-糖基化氨基酸之間消化的效率比ImpaRATOR更有效。具有完整唾液酸或Tn抗原的依那西普被OpeRATOR消化得非常弱（數(shù)據(jù)未顯示）。河北瑞典GenovisPNGaseF去糖基化酶瑞典GenovisGalactEXO中的酶來源于Akkermansia muciniphila，并在大腸桿菌中表達(dá)。

GlycOCATCH?親和純化：用于粘蛋白型O-糖蛋白和肽親和純化的富集樹脂。GlycOCATCH親和純化以方便的離心柱形式提供。該產(chǎn)品包含：4 個(gè) GlycOCATCH 親和純化微離心柱，每個(gè)柱能夠結(jié)合 50 μg 粘蛋白型 O-糖蛋白（總共 200 μg）。Genovis的SialEXO 凍干 200 單位，用于去除唾液酸；OpeRATOR 凍干 200 單位，用于結(jié)合的 O-糖蛋白的可選洗脫方法。1. 靶向 O-糖蛋白富集；2. 復(fù)雜樣品的特異性凈化；3. 用于改進(jìn) MS 分析的樣品制備。O-糖基化蛋白和肽的特異性富集：O-連接聚糖參與多種生物過程，包括抑制病原體引起的gan染、炎癥反應(yīng)、造血和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)。

Fc N-聚糖在抗體的效應(yīng)功能中起著至關(guān)重要的作用，但可能會(huì)增加蛋白質(zhì)表征測定的復(fù)雜性。在天然條件下用PNGase F去除Fc N-糖可以表征游離N-糖以及去糖基化抗體的功能和結(jié)構(gòu)。 為了證明PNGase F固定化和PNGase F凍干在天然反應(yīng)條件下有效去除Fc N-聚糖，對(duì)zhiliao性抗體曲妥珠單抗進(jìn)行了處理。圖2中的質(zhì)量數(shù)偏移表明，在37°C下用Genovis的PNGase F凍干或PNGase F固定化孵育1小時(shí)后，曲妥珠單抗上的Fc N-聚糖成功去除，與在溶液中用PNGase F凍干處理的樣品相比，沒有酶干擾用PNGase F固定處理的樣品的分析。OglyZOR 是一種內(nèi)切糖苷酶用于確認(rèn)O-糖的存在和降低樣品的異質(zhì)性。

genovis分析依那西普和曲妥珠單抗游離聚糖：為了確認(rèn)依那西普和曲妥珠單抗中半乳糖損失的LC-MS數(shù)據(jù)，進(jìn)行了釋放的N-聚糖分析。標(biāo)記的N-聚糖的分離清楚地表明了依那西普和曲妥珠單抗上半乳糖的丟失，如半乳糖基化聚糖物種的信號(hào)丟失所示。該酶是一種有價(jià)值的工具，可降低樣品異質(zhì)性，用于分析攜帶α連接的 GalNAc 殘基作為未成熟截短he心 1 的復(fù)雜 O-糖蛋白。1. 高效 α-N-乙酰半乳糖胺酶 – 快速、完全去除 Tn-抗原和 α1-3-連接的 GalNAc；2. 實(shí)現(xiàn)完全糖基去除，以改善蛋白質(zhì)表征；3. 可固定在即用型離心柱中。在天然條件下使用OmniGLYZOR Microspin色譜柱，可在3小時(shí)內(nèi)有效去除C1 抑制劑O-聚糖。河北高活性/無非特異酶活PNGaseF去糖基化酶生物藥物開發(fā)

PNGase F是一種非常成熟的工具。O-糖的去除可能更具挑戰(zhàn)性，現(xiàn)有的O-糖釋放化學(xué)方法不太適合下游分析。浙江PNGaseF去糖基化酶疾病機(jī)理研究

由于蛋白質(zhì)的O-糖模式的異質(zhì)性和O-糖結(jié)構(gòu)的OpeRATOR特異性，形成了重疊的肽，從而可以獲得O-糖位點(diǎn)的完整圖譜為了進(jìn)行比較，相同材料的標(biāo)準(zhǔn)胰蛋白酶消化物， 顯示難以分析的少量且非常大的糖肽。使用Genovis的OpeRATOR進(jìn)行O-糖位點(diǎn)定位：OpeRATOR 是一種 O-聚糖特異性蛋白酶，可消化絲氨酸和蘇氨酸糖基化位點(diǎn)的粘蛋白型 O-糖蛋白 N 端。這會(huì)產(chǎn)生攜帶O-糖的糖肽，并能夠使用質(zhì)譜法進(jìn)行O-糖分析、O-糖肽圖譜以及中級(jí)分析。下面是OpeRATOR消解位點(diǎn)的示意圖。浙江PNGaseF去糖基化酶疾病機(jī)理研究