山西高活性/無非特異酶活PNGaseF去糖基化酶疾病機(jī)理研究

我們展示了使用兩種蛋白作為底物的OmniGLYZOR的性能。依那西普是一種 Fc 融合蛋白，含有 TNFα 受體的胞外結(jié)構(gòu)域。該結(jié)構(gòu)域用 2 個(gè) N-糖和 8-11 個(gè) 1 個(gè)具有不同程度唾液酸化的 O-聚糖修飾。在 37°C 下將這種重糖基化蛋白在 OmniGLYZOR Microspin 柱上孵育 1 小時(shí)，可完全去除所有 N-和 O-糖，如中級(jí) LC-MS 分析所示。促紅xibao生成素 （EPO） 是一種攜帶 3 個(gè) N-聚糖和 1 個(gè)he心 1 個(gè) O-聚糖的小蛋白質(zhì)，其總質(zhì)量的近 40% 由聚糖組成。O-連接聚糖通常存在于蛋白質(zhì)的暴露位置，因?yàn)樗鼈冊(cè)诘鞍踪|(zhì)折疊發(fā)生后附著。只有負(fù)責(zé)其合成的糖基轉(zhuǎn)移酶才能接觸到這些暴露的位點(diǎn)。OglyZOR 酶可有效水解天然糖蛋白中的he心 1 二糖 （Gal-β1,3-GalNAc）；山西高活性/無非特異酶活PNGaseF去糖基化酶疾病機(jī)理研究

在Genovis的PNGaseF去除N-聚糖并用SialEXO和GalactEXO截?cái)郞-聚糖后，在質(zhì)譜圖中觀察到幾個(gè)與GalNAcs相關(guān)的峰。為了去除剩余的GalNAc殘基，應(yīng)用GalNAcEXO酶。用GalNAcEXO處理后觀察到的單個(gè)蛋白峰顯示完全去除剩余的GalNAcs。?GalNAcEXO在生理緩沖液和中性pH值中具有活性，使其與大多數(shù)樣品相容。此外，GalNAcEXO的活性不依賴于任何可能影響LC-MS分析的輔因子，如BSA。根據(jù)底物的性質(zhì)，糖蛋白的GalNAcEXO反應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)完成，而更復(fù)雜的樣品可能需要孵育過夜。Genovis的GalNAcEXO也可固定在離心柱中，以便快速方便地處理樣品，在制備過程中不會(huì)殘留酶。黑龍江用于自動(dòng)化系統(tǒng)的96孔板形式PNGaseF去糖基化酶使用FabRICATOR?將曲妥珠單抗消化成亞基，并使用LC-MS進(jìn)行分析。

GlycOCATCH設(shè)計(jì)用于特異性結(jié)合粘蛋白型O-糖基化蛋白和肽。親和樹脂基于無活性的Genovis的OpeRATOR酶，該酶經(jīng)過工程設(shè)計(jì)，可以高親和力結(jié)合O-糖基化蛋白和肽。 結(jié)合在pH 5-8的生理緩沖液中進(jìn)行。由于GlycOCATCH樹脂和O-糖蛋白/肽之間的強(qiáng)相互作用，可以用8M尿素進(jìn)行洗脫?；蛘?，可以使用活性O(shè)peRATOR酶進(jìn)行洗脫，該酶消化O-聚糖位點(diǎn)的N末端結(jié)合的O-糖蛋白。在后一種情況下，肽在天然條件下回收。OpeRATOR 凍干酶包含在購(gòu)買中。由于 O-糖蛋白上的旋亞氨酸化 O-聚糖與樹脂結(jié)合效率更高，因此唾液酸酶混合物 SialEXO 凍干也包含在購(gòu)買中。

為了證明Genovis的PNGase F凍干和PNGase F固定在各種底物上的去糖基化能力，用PNGase F凍干或PNGase F固定化處理了一系列糖蛋白。使用天然反應(yīng)條件在一小時(shí)內(nèi)有效去除曲妥珠單抗和依那西普上的所有N-糖，以及西妥昔單抗上的Fc-糖。當(dāng)加入RapiGest?并在變性條件下進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，西妥昔單抗的所有N-聚糖（包括Fab-聚糖）在PNGase F固定化10分鐘內(nèi)完全去除，PNGase F固定化15分鐘內(nèi)完全去除。在變性反應(yīng)條件下，PNGase F 在 30 分鐘內(nèi)成功將更復(fù)雜的 F 融合蛋白阿巴西普和阿柏西普去糖基化。使用變性和還原反應(yīng)條件，將常用的糖蛋白標(biāo)準(zhǔn)品RNase B在10或15分鐘內(nèi)完全去糖基化，分別使用PNGase F凍干或PNGase F固定化。在天然和變性條件下生成的去糖基化樣品與LC-MS分析兼容。SialEXO酶來源于Akkermansia muciniphila，并在大腸桿菌中表達(dá)。

蛋白質(zhì)的N-糖基化特征是一個(gè)關(guān)鍵的質(zhì)量屬性。它會(huì)影響生物制藥的安全性和有效性，因此需要在開發(fā)和生產(chǎn)過程中進(jìn)行表征和監(jiān)測(cè)。常見的聚糖分析工作流程是用PNGase F釋放N-聚糖，然后用熒光標(biāo)記物（如2-AB、2-AA、普魯卡因胺或RapiFluor-MS?（沃特世公司））標(biāo)記生成的聚糖。然后使用HILIC-HPLC或毛細(xì)管電泳分離標(biāo)記的聚糖，以表征和定量不同的聚糖結(jié)構(gòu)。 在這里，使用游離聚糖方法分析zhiliao性抗體曲妥珠單抗、Fc-融合蛋白依那西普和糖蛋白R(shí)Nase B的N-聚糖。曲妥珠單抗和依那西普在天然條件下在37°C下用Genvois的PNGase F去糖基化1小時(shí)，而RNase B需要變性和還原才能完全去糖基化。因此，在50°C下用PNGase F去糖基化10分鐘之前，用RapiGest? SF表面活性劑（沃特世公司）和TCEP處理RNase B。 用RapiFluor-MS標(biāo)記所得游離的聚糖，并通過HILIC UPLC-FLD-MS進(jìn)行分析。OglyZOR以凍干粉的形式提供，裝在 2000 個(gè)單位的小瓶中，用于在 2 mg 糖蛋白上水解he心 1 O-聚糖。山西固定化小柱形式PNGaseF去糖基化酶

依那西普的磷性能測(cè)試?：PNGaseF去除N-聚糖。山西高活性/無非特異酶活PNGaseF去糖基化酶疾病機(jī)理研究

Genovis的ImpaRATOR? 和 OpeRATOR? - 兩種協(xié)同的作用：O-糖蛋白酶。使用ImpaRATOR或OpeRATOR消化后分析依那西普重糖基化區(qū)域O-聚糖位點(diǎn)的覆蓋率（圖3）。使用OpeRATOR鑒定對(duì)應(yīng)于所有13個(gè)O-聚糖位點(diǎn)的肽，而使用ImpaRATOR只能明確鑒定10個(gè)位點(diǎn)。ImpaRATOR 可能比 OpeRATOR （1） 具有更具選擇性的氨基酸序列偏好，此處由 S186 和 T245 位點(diǎn)缺乏消化來表明。此外，ImpaRATOR 在兩個(gè)相鄰的 O-糖基化氨基酸之間顯示出有限的裂解，如 S213 位點(diǎn)酶解肽的缺乏以及 T200 和 T217 位點(diǎn)酶解肽的低強(qiáng)度所證明的那樣。在OpeRATOR酶解樣品（T184-S199和T200-H204;圖2b和d），而在ImpaRATOR消化的樣品中，具有漏裂的相應(yīng)肽（S184-H204）的強(qiáng)度更高。 雖然OpeRATOR顯示出更高的O-聚糖位點(diǎn)覆蓋率，但使用ImpaRATOR進(jìn)行消化可以表征O-聚糖結(jié)構(gòu)，包括唾液酸化物種。例如，條形圖插入顯示了兩種糖肽 T184-V198 和 T205-P207 的 O-聚糖種類。這應(yīng)該與使用OpeRATOR的消化進(jìn)行比較，在OpeRATOR中，必須去除唾液酸才能產(chǎn)生酶活性，這意味著有關(guān)唾液酸化的信息丟失?？偠灾?，ImpaRATOR 和 OpeRATOR 酶共同提供了有關(guān)聚糖組成和 O-聚糖位點(diǎn)的完整信息。山西高活性/無非特異酶活PNGaseF去糖基化酶疾病機(jī)理研究