浙江FabULOUSIdeS蛋白酶蛋白組學(xué)

Genovis將固定化酶固定在磁珠上，用于在鉸鏈下方自動(dòng)消化IgG。FabRICATOR（IdeS）是一種IgG特異性半胱氨酸蛋白酶，可消化鉸鏈下方單個(gè)氨基酸位點(diǎn)的抗體，產(chǎn)生均質(zhì)的F（ab'）2和Fc片段。FabRICATORMagIC磁珠含有FabRICATOR固定化酶。這些微球能夠在中級(jí)表征工作流程中并行快速自動(dòng)酶解多種抗體。它們專為自動(dòng)化平臺(tái)而設(shè)計(jì)，但在無(wú)法實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化的情況下，在振動(dòng)臺(tái)上的表現(xiàn)同樣出色。酶切消解后，樣品可直接轉(zhuǎn)移到LC-MS的自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)行快速色譜分析，或轉(zhuǎn)移到其他分析方法進(jìn)行分析。自動(dòng)平行抗體酶切和亞基生成允許處理與克隆選擇、工藝開發(fā)和潛在生物制藥穩(wěn)定性研究相關(guān)的大量樣品。自動(dòng)抗體亞基分析可減少操作人員的時(shí)間和樣品處理錯(cuò)誤的風(fēng)險(xiǎn)，并提高通量。LC-MS中級(jí)分析用于快速表征mAb和其他基于IgG的生物制藥。浙江FabULOUSIdeS蛋白酶蛋白組學(xué)

大多數(shù)zhiliao性抗體都攜帶人IgG1骨架，雙特異性和多特異性形式的開發(fā)正在迅速增加。此類抗體的分析需要特異性酶來(lái)表征特性，例如單價(jià)結(jié)合、二硫鍵擾亂和配對(duì)Fc糖基化。傳統(tǒng)方案包括使用木瓜蛋白酶和Lys-C的酶消化，這需要優(yōu)化以極大限度地減少過(guò)度消化并獲得足夠的產(chǎn)量。Genovis的FabDELLO與IdeS酶具有不同的特異性，它在鉸鏈上方的單個(gè)位點(diǎn)消化人IgG1，并產(chǎn)生完整的Fab和Fc片段。為了證明FabDELLO的特異性活性，通過(guò)非還原SDS-PAGE消化和分析了IgG1和Fc融合蛋白的選擇。所有底物均實(shí)現(xiàn)了完全消化，包括具有其他困難的LALA和LFLE突變的IgG1。FabDELLO酶在底物上的精確和有效性能驗(yàn)證了其在生物制藥開發(fā)中的用途。陜西IgGZEROIdeS蛋白酶IgG特異性蛋白酶Genovis還提供了在瓊脂糖樹脂上固定化的酶，在隨時(shí)可用的離心柱中，這可以大限度地減少在樣品中殘留的酶。

Genovis的FabRICATOR MagIC自動(dòng)樣品制備可用于分析和監(jiān)測(cè)不同的CQA。mAb在生產(chǎn)或儲(chǔ)存過(guò)程中的氧化就是這樣一種CQA，可能會(huì)影響zhiliao產(chǎn)品的質(zhì)量。為了展示FabRICATOR MagIC如何解決這個(gè)問(wèn)題，對(duì)6種mAb的混合物進(jìn)行強(qiáng)制降解（室溫下3個(gè)月），并通過(guò)反相LC-MS進(jìn)行分析。當(dāng)在完整水平上分析mAb時(shí)，可以檢測(cè)到mAb5豐度的顯著差異，同時(shí)出現(xiàn)許多新的峰。然而，無(wú)法獲得可靠的質(zhì)量數(shù)據(jù)。使用FabRICATOR MagIC，mAb5變化的來(lái)源在Fab區(qū)域內(nèi)。隨后還原為 Fc/2、LC 和 Fd' 片段，可以識(shí)別差異是由于 mAb5 Fd' 片段上的色氨酸氧化，通過(guò)形成氧代內(nèi)酯 （+14 Da） 和二氧代內(nèi)酯 （+30 Da） 以及 mAb5 LC （-18 Da） 的琥珀酰亞胺化來(lái)揭示。此外，還可檢測(cè)到mAb3輕鏈的異構(gòu)化。該示例說(shuō)明了FabRICATOR MagIC在mAb中級(jí)分析中的強(qiáng)大功能，它創(chuàng)建的片段足夠小，可以精確定位特定的修飾，而無(wú)需耗時(shí)耗費(fèi)資源的肽圖分析，所有這些都以相對(duì)較少的手動(dòng)操作時(shí)間快速完成。

與IdeS不同，Genovis的GingisKHAN（Kgp）是一種半胱氨酸蛋白酶，可在鉸鏈上方的單個(gè)位點(diǎn)（KSCDK/THTCPPC）消化人IgG1，產(chǎn)生完整且均質(zhì)的Fab和Fc片段。GingisKHAN是一種賴氨酸特異性蛋白酶。單一的消化位點(diǎn)是人IgG1三維結(jié)構(gòu)的結(jié)果，使這種賴氨酸暴露于酶中。如果去除N-聚糖，則Fc上暴露的賴氨酸處可能會(huì)出現(xiàn)額外的消化位點(diǎn)。GingisKHAN需要溫和的還原條件才能具有活性，并且在37°C和pH8下獲得活性。還原劑（2mM半胱氨酸）與酶一起提供。GingisKHAN是從牙齦卟啉單胞菌中純化的。該酶用于使用LC-MS表征基于抗體的生物zhiliao藥物，研究Fc聚糖分析、雙特異性抗體、親和力和親和力效應(yīng)，并鑒定翻譯后修飾。為了分別研究度拉糖肽的肽和 Fc 區(qū)域，從而鑒定結(jié)構(gòu)域特異性 PTM。

蛋白酶用于生成肽，用于質(zhì)譜分析蛋白質(zhì)。這些應(yīng)用包括蛋白質(zhì)組學(xué)和生物制藥的深度表征。由于遺漏了切割和樣品制備誘導(dǎo)的偽影，傳統(tǒng)的蛋白酶并不總是理想的，因此需要具有不同特異性的蛋白酶工具箱。Genovis的GingisREX 是一種精氨酸特異性蛋白酶，可將蛋白質(zhì) C 末端消化為精氨酸殘基。與胰蛋白酶肽相比，所得肽更長(zhǎng)，并可能導(dǎo)致序列覆蓋率增加。質(zhì)譜分析中蛋白酶的特異性對(duì)于獲得高質(zhì)量的數(shù)據(jù)集和避免復(fù)雜的數(shù)據(jù)解釋至關(guān)重要。作為模型底物，使用胰島素氧化β鏈來(lái)比較 GingisREX 和 ArgC 的酶特異性。胰島素氧化β鏈含有一個(gè)精氨酸和一個(gè)賴氨酸殘基。在RP-HPLC和質(zhì)譜法上分析GingisREX和ArgC的酶切肽。GingisREX在賴氨酸殘基上沒(méi)有酶活性或其他額外活性，即使在長(zhǎng)時(shí)間孵育過(guò)夜后，酶與底物的比例也很高（1：5）。然而，ArgC在精氨酸殘基上顯示出主要活性，但在賴氨酸殘基上也可以看到酶消化。在酶與底物的比例為 1：20 和過(guò)夜孵育下，證明了 ArgC 的額外非特異性活性。在相同條件下，GingisREX未檢測(cè)到這種情況。數(shù)據(jù)證實(shí)了GingisREX精氨酸殘基的特異性活性，并顯示使用Arg-C在賴氨酸和其他殘基處的非特異性消化。Genovis提供具有低水平內(nèi)du素的FabRICATOR （IdeS）凍干。陜西GlySERIASIdeS蛋白酶抗體酶切

倍篤生物代理多條產(chǎn)品線，用于聚糖分析用酶、ADC偶聯(lián)技術(shù)、QED抗體對(duì)、AAV中和抗體、IdeS蛋白酶等。浙江FabULOUSIdeS蛋白酶蛋白組學(xué)

為了讓所有實(shí)驗(yàn)室都能同時(shí)快速自動(dòng)消化多種抗體，Genovis的FabRICATORMagIC的設(shè)計(jì)具有靈活性，適用于一系列自動(dòng)化平臺(tái)。我們?cè)赥hermoScientific?KingFisher?純化系統(tǒng)上優(yōu)化了FabRICATORMagIC的工作流程，但它可以轉(zhuǎn)移到其他自動(dòng)化平臺(tái)，如果沒(méi)有自動(dòng)化，在振動(dòng)臺(tái)上也能同樣出色地工作。消解后，將含有處理樣品的深孔板直接轉(zhuǎn)移到LC-MS的自動(dòng)進(jìn)樣器中進(jìn)行快速色譜分析，或轉(zhuǎn)移到其他分析方法進(jìn)行分析。FabRICATORMagIC與在消解緩沖液中添加0.05%聚山梨醇酯20兼容，以極大限度地減少自動(dòng)化系統(tǒng)中可能發(fā)生的純粹壓力。使用KingFisher儀器處理樣品時(shí)，樣品制備非常簡(jiǎn)單。將樣品、樹脂和緩沖液移液到指定的孔或板中，然后將板放入儀器中。設(shè)計(jì)用于FabRICATORMagIC的BindIt?協(xié)議將控制每個(gè)步驟的孵育溫度和時(shí)間。浙江FabULOUSIdeS蛋白酶蛋白組學(xué)