陜西培養(yǎng)基條件中鹽核酸酶

Mayer等（2023）以measles virus(麻疹病毒，MV)為例，評(píng)估了四種不同核酸酶（BenzonaseTM、DeneraseTM、M-SAN HQ中鹽核酸酶及SAN HQ高鹽核酸酶）對(duì)于染色質(zhì)DNA去除的效果。Vero細(xì)胞通過(guò)微載體貼壁培養(yǎng)來(lái)生產(chǎn)麻疹病毒MV，72hr后收獲上清液，使用3μm cellulose filter(Sartorius)過(guò)濾后分裝多份，置于-80℃保存便于后續(xù)使用。在解凍后的上清中調(diào)節(jié)對(duì)應(yīng)鹽濃度，并加入50 U/ml核酸酶，37℃孵育2hr進(jìn)行消化，消化后留樣；將消化后上清液過(guò)Capto Core 700 (Cytiva)柱子，收集流穿液，之后洗雜、洗脫，并分別留樣。通過(guò)SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)，相比Benzonase等傳統(tǒng)核酸酶，在生理鹽條件下M-SAN HQ中鹽核酸酶更高效將染色質(zhì)DNA剪切成更小片段，甚至將核小體DNA剪切更徹底。M-SAN HQ ELISA Kit能夠定量檢測(cè)M-SAN HQ中鹽核酸酶殘留。陜西培養(yǎng)基條件中鹽核酸酶

在不同的鹽濃度條件下，AAV病毒載體的存在形式不同。低鹽濃度條件下，AAV病毒顆粒表面會(huì)通過(guò)電荷作用等非特異結(jié)合到HCD上，從而產(chǎn)生病毒顆粒團(tuán)聚現(xiàn)象。隨著溶液鹽濃度上升，AAV病毒顆粒與HCD的離子相互作用會(huì)被破壞，AAV病毒顆粒會(huì)逐漸解離。當(dāng)鹽濃度升到更高范圍（>400mM左右），AAV病毒顆粒與HCD的結(jié)合更弱，AAV顆粒更穩(wěn)定。因此，在高鹽濃度溶液中，AAV顆粒更加穩(wěn)定，且有數(shù)據(jù)表明高鹽濃度不會(huì)削弱AAV的侵染能力。所以，我們推薦提高AAV病毒生產(chǎn)中的鹽濃度。湖南中鹽核酸酶70950-150Medium-Salt Active Nuclease High Quality (M-SAN HQ），中文名稱(chēng)中鹽核酸酶。

ArcticZymes Technologies產(chǎn)品大都來(lái)源于深海microbes中，具有一些共同的特性。1. 熱不穩(wěn)定性，使酶產(chǎn)品相對(duì)容易失活，簡(jiǎn)化工作流程，方便自動(dòng)化過(guò)程；2. 低溫活性，即在低溫或常溫下具有更高活性，縮短酶與底物的孵育時(shí)間，提高反應(yīng)速度及效率；3. 耐鹽特性，是指大部分酶產(chǎn)品能耐受較高的鹽濃度，拓寬反應(yīng)體系范圍選擇，在特殊體系的應(yīng)用場(chǎng)景下具有更為出色的性能表現(xiàn)；4. 獨(dú)特特性，極限酶類(lèi)產(chǎn)品能夠在非常規(guī)條件下進(jìn)行酶促反應(yīng)，讓一些反應(yīng)從不可能變?yōu)榭赡堋?/p>

大規(guī)模生產(chǎn)階段，AAV/LV載體生產(chǎn)流程跟抗體、疫苗類(lèi)藥物的生產(chǎn)類(lèi)似，主要包含上游培養(yǎng)、下游純化及制劑部分。上游培養(yǎng)分為質(zhì)粒開(kāi)發(fā)、細(xì)胞擴(kuò)增、三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染及病毒載體生產(chǎn)等步驟。下游純化分為細(xì)胞裂解釋放AAV病毒顆粒（可以通過(guò)去污劑、機(jī)械作用、高滲或凍融操作等）or收獲細(xì)胞上清液得到含LV病毒原液、加入核酸酶以減少宿主細(xì)胞核酸污染、澄清是通過(guò)離心或過(guò)濾等方法去除細(xì)胞碎片和雜質(zhì)等、超濾濃縮以減少后續(xù)色譜純化體系、親合及離子交換等純化得到高純度病毒載體。制劑部分主要是超濾更換緩沖液、過(guò)濾除菌及制劑灌裝等。M-SAN HQ中鹽核酸酶生產(chǎn)符合ISO 13485:2016規(guī)范，提供相關(guān)文件用于申報(bào)。

此外，文章作者對(duì)每個(gè)步驟的樣品進(jìn)行納米顆粒分析（NTA），結(jié)果發(fā)現(xiàn)：澄清環(huán)節(jié)后，M-SAN HQ中鹽核酸酶和Benzonase處理組才出現(xiàn)比較明確的LV病毒顆粒峰；TFF處理后，回流液樣品的LV病毒顆粒峰更加尖銳，表明病毒顆粒分散度更好、穩(wěn)定性更高。回流液的NTA結(jié)果進(jìn)一步表明，M-SAN HQ中鹽核酸酶處理組只有一個(gè)病毒顆粒峰，而B(niǎo)enzonase處理組的回流液中有三個(gè)峰。作者推測(cè)Benzonase處理組的病毒顆粒還有嚴(yán)重的病毒團(tuán)聚現(xiàn)象，而呈現(xiàn)多峰現(xiàn)象。M-SAN HQ中鹽核酸酶在細(xì)胞培養(yǎng)鹽濃度下具有較高活性，縮短酶切時(shí)間、得到更短DNA片段；黑龍江M-SAN HQ中鹽核酸酶70950-160

相比于全能核酸酶，在生理鹽條件下M-SAN HQ中鹽核酸酶將染色質(zhì)DNA剪切成更小片段的效率更高。陜西培養(yǎng)基條件中鹽核酸酶

文章作者按照經(jīng)典的慢病毒載體生產(chǎn)流程操作，在融化、核酸酶消化、澄清、超濾等步驟留樣，分別檢測(cè)dsDNA濃度及功能性LV病毒滴度。經(jīng)過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，——去除主要發(fā)生在澄清環(huán)節(jié)，能去除dsDNA的80%-90%；2. M-SAN HQ中鹽核酸酶比Benzonase能更高效去除dsDNA，即M-SAN HQ組的TFF回流液中dsDNA殘留量是Benzonase組回流液的20%左右；3. LV病毒滴度在澄清環(huán)節(jié)損失30%-40%；4. M-SAN HQ組的TFF回流液中LV病毒滴度略高于Benzonase組的回流液數(shù)據(jù)。陜西培養(yǎng)基條件中鹽核酸酶