上海特殊樣本RT-PCR檢測(cè)技術(shù)研究方案

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)生物學(xué)研究的歷史中占據(jù)了重要的地位。以此為基礎(chǔ)發(fā)展出包括Real-time PCR在內(nèi)的多項(xiàng)應(yīng)用技術(shù)。自誕生后Real-time PCR技術(shù)持續(xù)發(fā)展，從簡(jiǎn)單的增擴(kuò)到整個(gè)PCR過(guò)程，Real-time PCR表現(xiàn)出比PCR更敏感、更明確的定量分析特性和對(duì)識(shí)別等位基因的能力。不少人以為real-time就是意味著可以在顯示器上看到每個(gè)循環(huán)增擴(kuò)曲線的增長(zhǎng)。事實(shí)并非如此，早期的軟件不能在運(yùn)行期間提供可視化的增擴(kuò)曲線。主要是因?yàn)镾DS軟件采用整個(gè)平臺(tái)較終的數(shù)據(jù)執(zhí)行數(shù)據(jù)分析工作，而不是分析每個(gè)單獨(dú)的反應(yīng)循環(huán)。對(duì)某些設(shè)備來(lái)說(shuō)，必須向分析軟件提供實(shí)時(shí)的數(shù)據(jù)，有些設(shè)備則不需要。前一種設(shè)備允許軟件實(shí)時(shí)跟蹤每個(gè)加樣口的增擴(kuò)曲線，同時(shí)顯示在電腦屏幕上。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（QuantitativeReal-time PCR）是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中。上海特殊樣本RT-PCR檢測(cè)技術(shù)研究方案

Real-time PCR：基線（baseline)：通常是3－15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)，同一次反應(yīng)中針對(duì)不同的基因需單獨(dú)設(shè)置基線。閾值（threshold)：自動(dòng)設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。手動(dòng)設(shè)置：置于指數(shù)擴(kuò)增期，剛好可以清楚地看到熒光信號(hào)明顯增強(qiáng)。同一次反應(yīng)中針對(duì)不同的基因可單獨(dú)設(shè)置閾值，但對(duì)于同一個(gè)基因擴(kuò)增一定要用同一個(gè)閾值。Ct值：與起始濃度的對(duì)數(shù)成線性關(guān)系，分析定量時(shí)候一般取Ct:15-35.太大或者太小都會(huì)導(dǎo)致定量的不準(zhǔn)確。相對(duì)定量：通過(guò)與內(nèi)參基因Ct值之間的相差來(lái)計(jì)算基因之間的表達(dá)差異,一般是2-△△Ct?；蛘呤强紤]擴(kuò)增效率的Pfaffl法。溫州微量熒光定量PCR方案實(shí)時(shí)設(shè)備的軟件能使收集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行正常化處理來(lái)彌補(bǔ)背景熒光的差異。

PCR的反應(yīng)條件：dNTP濃度過(guò)高會(huì)加快反應(yīng)速度，但同時(shí)還可以增加堿基的錯(cuò)誤摻入率。引物濃度過(guò)高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增。TaqDNA聚合酶濃度過(guò)高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增，低則合成產(chǎn)物量減少。TaqDNA聚合酶無(wú)校正功能，摻入錯(cuò)誤率達(dá)2*E-4個(gè)核苷酸，一個(gè)30個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)0.1%-0.25%總錯(cuò)誤率。在90～95度下可使整個(gè)基因組的DNA變性為單鏈。一般94～95度30～60s。時(shí)間過(guò)長(zhǎng)使TaqDNA聚合酶失活和dNTP破壞增多。DNA很快冷卻到40～60度使引物和模板結(jié)合。引物長(zhǎng)度在15～25時(shí)退火溫度。熱啟動(dòng)/冷完成聚合酶鏈反應(yīng)是通過(guò)新的雜合聚合酶實(shí)現(xiàn)的，這些酶在環(huán)境溫度下不活躍。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：因?yàn)镻CR擴(kuò)增了目的DNA區(qū)域，所以PCR可以用于分析極少量的樣品。這對(duì)于法醫(yī)檢定法，當(dāng)時(shí)只有微量的DNA可作為證據(jù)。聚合酶鏈反應(yīng)也可用于分析古代DNA那已經(jīng)有數(shù)萬(wàn)年的歷史了。這些基于聚合酶鏈反應(yīng)的技術(shù)已經(jīng)成功地應(yīng)用于動(dòng)物身上，例如四萬(wàn)年前猛犸，以及人類DNA，定量聚合酶鏈反應(yīng)或者實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)不要與逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)方法混淆)允許估計(jì)樣品中存在的給定序列的量——這種技術(shù)通常用于定量確定基因表達(dá)的水平。定量PCR是一種已建立的DNA定量工具，用于測(cè)量每輪PCR擴(kuò)增后DNA產(chǎn)物的積累。聚合酶鏈反應(yīng)的試劑應(yīng)分配到一次性的等分試樣中。Real-time PCR在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中注意避免mRNA的斷裂。

Real-time PCR從用途上分可以分為定性分析和定量分析：定性分析指的是用于分析待檢測(cè)的樣本中是否存在我們想要檢測(cè)的成分，即待檢測(cè)成分有無(wú)的分析。通常，定性分析可以應(yīng)用于病毒以及病原菌的檢測(cè)，物種鑒定以及基因分型等。病毒及病原菌檢測(cè)，如SARS、H1N1病毒，都可以通過(guò)Real-time PCR的方法進(jìn)行高靈敏度的檢測(cè)，定性分析樣本是否已被病毒傳播。物種鑒定如我們國(guó)家的一些檢驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu)，想要檢測(cè)進(jìn)口的牛肉制品中是否含有雞源、豬源或鴨源等成分，或者用于檢測(cè)羊奶中是否會(huì)摻有牛奶等等，可以通過(guò)Real-time PCR的方法進(jìn)行檢測(cè)?；蚍中?，如啤酒型，肥胖型基因的檢測(cè)，就是Real-time PCR在基因分型方面的應(yīng)用。聚合酶鏈反應(yīng)的這種能力增強(qiáng)了許多方法，例如生成雜交探針用于雜交。無(wú)錫骨頭RT-PCR檢測(cè)技術(shù)

Real-time PCR技術(shù)已經(jīng)被普遍用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞mRNA表達(dá)量的變化。上海特殊樣本RT-PCR檢測(cè)技術(shù)研究方案

聚合酶鏈反應(yīng)同時(shí)擴(kuò)增單個(gè)精子中幾個(gè)基因座的能力增強(qiáng)了極大地增強(qiáng)了通過(guò)研究減數(shù)分裂后染色體交叉來(lái)進(jìn)行基因定位的傳統(tǒng)任務(wù)。通過(guò)分析數(shù)千個(gè)單個(gè)精子，已經(jīng)直接觀察到非常緊密基因座之間罕見(jiàn)的交叉事件。類似地，可以分析異常的缺失、插入、易位或倒位，所有這些都無(wú)需等待(或支付)漫長(zhǎng)而艱苦的受精、胚胎發(fā)生等過(guò)程。定點(diǎn)突變：聚合酶鏈反應(yīng)可用于產(chǎn)生突變基因，突變由科學(xué)家隨意選擇?？梢赃x擇這些突變來(lái)理解蛋白質(zhì)是如何完成其功能的，并改變或改善蛋白質(zhì)功能。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的模板的取材主要依據(jù)PCR的擴(kuò)增對(duì)象，可以是病原體標(biāo)本如病毒、細(xì)菌、菌類等。上海特殊樣本RT-PCR檢測(cè)技術(shù)研究方案

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