南京分子生物學PCR檢測技術服務

Real-time PCR反應：多重連接依賴探針擴增（MLPA):允許用單個引物對擴增多個靶標，從而避免多重PCR的分辨率限制。多重聚合酶鏈反應:由單個PCR混合物中的多個引物組組成，以產生對不同DNA序列特異的不同大小的擴增子。通過同時靶向多個基因，可以從單次測試中獲得額外的信息，否則將需要幾次試劑和更多時間來執(zhí)行。每個引物組的退火溫度必須優(yōu)化，以在單個反應中正確工作，并符合擴增子尺寸。也就是說，當通過凝膠電泳可視化時，它們的堿基對長度應該足夠不同以形成不同的條帶。Real-time PCR與普通PCR的實驗目的不同，所以對引物的設計要求也不同。南京分子生物學PCR檢測技術服務

聚合酶鏈式反應的試驗污染：PCR反應的很大特點是具有較大擴增能力與極高的靈敏性，但令人腦袋不適的問題是易污染，極其微量的污染即可造成假陽性的產生。污染原因：標本間交叉污染：標本污染主要有收集標本的容器被污染，或標本放置時，由于密封不嚴溢于容器外，或容器外粘有標本而造成相互間交叉污染；標本核酸模板在提取過程中，由于吸樣污染導致標本間污染；有些微生物標本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴散，導致彼此間的污染。PCR試劑的污染：主要是由于在PCR試劑配制過程中，由于加樣、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。如果基因的基因組DNA序列是已知的，逆轉錄-聚合酶鏈反應可以用來繪制基因中外顯子和內含子的位置。南京分子生物學PCR檢測技術服務實時熒光定量PCR是一種在DNA擴增反應中，以熒光化學物質測聚合酶鏈式反應循環(huán)后產物總量的方法。

實時定量PCR的系統(tǒng)構成及工作原理：熒光定量檢測系統(tǒng)由實時熒光定量PCR儀，實時熒光定量試劑，通用電腦，自動分析軟件等構成。設備由熒光定量系統(tǒng)和計算機組成，用來監(jiān)測循環(huán)過程的熒光。與實時設備相連的計算機收集熒光數據。數據通過開發(fā)的實時分析軟件以圖表的形式顯示。原始數據被繪制成熒光強度相對于循環(huán)數的圖表。原始數據收集后可以開始分析。實時設備的軟件能使收集到的數據進行正?；幚韥韽浹a背景熒光的差異。正常化后可以設定域值水平，這就是分析熒光數據的水平。

Real-time PCR從用途上分可以分為定性分析和定量分析：定性分析指的是用于分析待檢測的樣本中是否存在我們想要檢測的成分，即待檢測成分有無的分析。通常，定性分析可以應用于病毒以及病原菌的檢測，物種鑒定以及基因分型等。病毒及病原菌檢測，如SARS、H1N1病毒，都可以通過Real-time PCR的方法進行高靈敏度的檢測，定性分析樣本是否已被病毒傳播。物種鑒定如我們國家的一些檢驗檢疫機構，想要檢測進口的牛肉制品中是否含有雞源、豬源或鴨源等成分，或者用于檢測羊奶中是否會摻有牛奶等等，可以通過Real-time PCR的方法進行檢測。基因分型，如啤酒型，肥胖型基因的檢測，就是Real-time PCR在基因分型方面的應用。PCR反應的很大特點是具有較大擴增能力與極高的靈敏性。

聚合酶鏈式反應：因為PCR擴增了目的DNA區(qū)域，所以PCR可以用于分析極少量的樣品。這對于法醫(yī)檢定法，當時只有微量的DNA可作為證據。聚合酶鏈反應也可用于分析古代DNA那已經有數萬年的歷史了。這些基于聚合酶鏈反應的技術已經成功地應用于動物身上，例如四萬年前猛犸，以及人類DNA，定量聚合酶鏈反應或者實時聚合酶鏈反應不要與逆轉錄-聚合酶鏈反應方法混淆)允許估計樣品中存在的給定序列的量——這種技術通常用于定量確定基因表達的水平。定量PCR是一種已建立的DNA定量工具，用于測量每輪PCR擴增后DNA產物的積累。聚合酶鏈反應的試劑應分配到一次性的等分試樣中。Real-time PCR提高實驗的重復性。南京微量熒光定量PCR供應商

Real-time PCR在實驗過程中為了防止非特異性擴增，必須設陰性對照。南京分子生物學PCR檢測技術服務

引物的設計注意事項：1，引物設計要跨內含子，不能在一個外顯子上（我們的實驗是以cDNA為模板來擴增的，如果有DNA污染的話，因為DNA上含有分子量很大的內含子，不可能完成擴增。這對我們消除整個實驗的誤差起很大的作用）。2，引物設計的時候要盡可能設計在同一退火溫度，方便于以后同時擴增很多不同的基因片段。但是如果相差比較大，就得分開做，浪費模板，浪費管家基因，所以每個實驗室設計引物的時候要盡可能一致，這樣就不用每次查退火溫度，且對整個實驗有利。南京分子生物學PCR檢測技術服務

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