蘇州細(xì)胞生物學(xué)膜片鉗技術(shù)方案

膜片鉗實(shí)驗(yàn)常見問題及解決方法：膜片鉗技術(shù)是電生理記錄的常用手段，目前在科學(xué)研究中使用越來越普遍。但在具體膜片鉗實(shí)驗(yàn)操作的過程中，總會遇到各種各樣的問題，對實(shí)驗(yàn)人員造成很多困擾。本次講座主要從實(shí)驗(yàn)角度出發(fā)，以簡單，實(shí)用的原則，著重講解實(shí)驗(yàn)中遇到的各種問題，以及解決方法。從選擇實(shí)驗(yàn)樣本開始，按照一般實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的順序，逐步延伸，一直到如何搭建自己個(gè)性化的膜片鉗系統(tǒng)，使大家對膜片鉗的基礎(chǔ)知識以及膜片鉗實(shí)驗(yàn)中遇到的各種典型問題及解決辦法有系統(tǒng)的了解。膜片鉗技術(shù)的應(yīng)用范圍：膜片鉗技術(shù)在通道中的研究。蘇州細(xì)胞生物學(xué)膜片鉗技術(shù)方案

膜片鉗電生理技術(shù)的樣本種類：從較早的肌細(xì)胞、神經(jīng)元和內(nèi)分泌細(xì)胞發(fā)展到血細(xì)胞、肝細(xì)胞、耳蝸毛細(xì)胞、胃壁細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞、精母細(xì)胞等多種細(xì)胞；從急性分散細(xì)胞和培養(yǎng)細(xì)胞發(fā)展到組織片乃至整體動物；從蝸牛、青蛙、蠑螈、爪蟾母細(xì)胞發(fā)展到雞細(xì)胞、大鼠細(xì)胞、人細(xì)胞等；從動物細(xì)胞發(fā)展到細(xì)菌及植物細(xì)胞。此外，膜片鉗技術(shù)還普遍地應(yīng)用到平面雙分子層（planarbilayer）、脂質(zhì)體（liposome）等人工標(biāo)本上。研究對象：從對離子通道（配體門控性離子通道、電壓門控性離子通道、第二信使介導(dǎo)的離子通道、機(jī)械敏感性離子通道及縫隙連接通道等）的研究發(fā)展到對離子泵、交換體及可興奮細(xì)胞的胞吞、胞吐機(jī)制的研究等。膜片鉗電極已不單單是傳統(tǒng)意義上的電信號記錄電極，它還可作為其他研究方法的工具使用，如用于進(jìn)行單細(xì)胞PCR技術(shù)時(shí)的細(xì)胞內(nèi)容物抽吸。無錫細(xì)胞生物學(xué)膜片鉗技術(shù)原理及步驟為了測量在不同藥物對細(xì)胞中的離子通道的影響，通常需要在膜片鉗實(shí)驗(yàn)中實(shí)施灌流。

膜片鉗電生理技術(shù)的記錄方式：全細(xì)胞記錄法，膜穿孔記錄法（perforatedpatchclamp），巨膜片鉗記錄法（giantmembranepatchclamp），松散封接記錄法（loosepatchclamp）等技術(shù)應(yīng)用：1.為了更換電極內(nèi)液和從電極內(nèi)施加藥物，發(fā)展了微電極內(nèi)灌技術(shù)（micropipetteperfusiontechnique）2.在研究細(xì)胞間的縫隙連接（gapjunction）通路時(shí)，發(fā)展了雙膜片鉗記錄法（doublepatchrecording）3.將富含神經(jīng)遞質(zhì)受體的游離膜片鉗靠近突觸部位，可檢測遞質(zhì)釋放和突觸活動，這一技術(shù)稱為膜片鉗探針技術(shù)（detector-patchtechnique）4.將特異的膜片探針插入卵母細(xì)胞，可檢測細(xì)胞內(nèi)第二信使含量，此為膜片填塞技術(shù)（patchcrammingtechnique）5.為研究細(xì)胞的胞吞與胞吐機(jī)制，發(fā)展了膜電容測定法（membranecapacitancemeasurement）。

膜片鉗法的各種模式：膜外面向內(nèi)模式：從全細(xì)胞模式將膜片微電極向上提起可得到切割分離的膜片，由于它的細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)面面對膜片微電極腔內(nèi)液，膜外面自然封閉而對外，所以這個(gè)模式被稱為莫外面向內(nèi)模式。開放細(xì)胞吸附膜內(nèi)面向外模式：將細(xì)胞吸附模式的膜片以外的某部位的胞膜進(jìn)行機(jī)械地破壞，經(jīng)破壞孔調(diào)控細(xì)胞內(nèi)液并在細(xì)胞吸附狀態(tài)下進(jìn)行內(nèi)面向外的單一離子通道記錄。穿孔囊泡膜外面向外模式：從穿孔膜片模式將膜片微電極向上提起，便在微電極尖銳端處形成一個(gè)膜囊泡，如果條件較好，此膜囊泡內(nèi)不只有細(xì)胞質(zhì)因子還可有線粒體等細(xì)胞器存在。膜片鉗技術(shù)的應(yīng)用范圍：創(chuàng)新藥物研究與高通量篩選的研究。

膜片鉗技術(shù)操作方法：開始封接:調(diào)低微操步進(jìn)速度，使電極尖銳端慢慢向細(xì)胞靠近，如發(fā)現(xiàn)基線方波突然變小，封接電阻上升時(shí)，即停止電極下降，通過注射器給電極負(fù)壓，封接成功的可見方波很快變小，電阻升至G歐。此時(shí)，調(diào)節(jié)快電容補(bǔ)償按鈕，將快電容電流補(bǔ)償?shù)?，如封接穩(wěn)定后，準(zhǔn)備破膜。破膜:在鉗制電位水平-60mV時(shí)，漏電流<20pA，給予比較大的負(fù)壓(也可根據(jù)情況使用ZAP電破方式破膜)，將要破時(shí)可見基線上下浮動，破后，可見基線前后有兩個(gè)較大的慢電容電流。全自動膜片鉗系統(tǒng)技術(shù)指標(biāo)：信號準(zhǔn)確，噪聲少，使用了先進(jìn)的微型“法拉第板”替代傳統(tǒng)的“法拉第籠”。莆田醫(yī)學(xué)腦定位膜片鉗原理

膜片鉗技術(shù)的應(yīng)用范圍：對藥物作用機(jī)制的研究。蘇州細(xì)胞生物學(xué)膜片鉗技術(shù)方案

膜片鉗技術(shù)之全細(xì)胞記錄的實(shí)驗(yàn)流程：（1）仔細(xì)檢查實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)各儀器間的線路連接。（2）依次打開各儀器的電源開關(guān)和實(shí)驗(yàn)軟件，檢查各參數(shù)的初始設(shè)置。（3）將樣品置于倒置顯微鏡的載物臺上。（4）電極安裝。（5）偏移電位的補(bǔ)償和電極電阻的測定：在微操縱器控制下使微電極進(jìn)入浴液，電流基線通常會立刻漂離零位，若此時(shí)處于VC模式，在維持電壓為零時(shí)，通過調(diào)節(jié)偏移電位補(bǔ)償，使電流基線等于零，此時(shí)可見基線上疊加有響應(yīng)電流方波。（6）細(xì)胞封接。（7）電極電容補(bǔ)償：若無特殊要求，一般將保持電位設(shè)為受試細(xì)胞靜息電位平均值。蘇州細(xì)胞生物學(xué)膜片鉗技術(shù)方案

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