廣州微量RT-PCR檢測(cè)技術(shù)原理

所謂real-timeQ-PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基因，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，之后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。在real-time技術(shù)的發(fā)展過(guò)程中，兩個(gè)重要的發(fā)現(xiàn)起著關(guān)鍵的作用：（1）TaqDNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的發(fā)現(xiàn)，它能降解特異性熒光記探針，因此使得間接的檢測(cè)PCR產(chǎn)物成為可能。（2）此后熒光雙標(biāo)記探針的運(yùn)用使在一密閉的反應(yīng)管中能實(shí)時(shí)地監(jiān)測(cè)反應(yīng)全過(guò)程。這兩個(gè)發(fā)現(xiàn)的結(jié)合以及相應(yīng)的儀器和試劑的商品化發(fā)展導(dǎo)致real-timeQ-PCR方法在研究工作中的運(yùn)用。實(shí)時(shí)熒光定量PCR是目前確定樣品中DNA(或cDNA)拷貝數(shù)較敏感、較準(zhǔn)確的方法。廣州微量RT-PCR檢測(cè)技術(shù)原理

Real-time PCR：Ct值與起始模板的線(xiàn)性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對(duì)數(shù)存在線(xiàn)性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測(cè)定，因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)定量的方法。外標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴(lài)的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量較準(zhǔn)確，重現(xiàn)性較好的定量方法，已得到全世界的公認(rèn)，普遍用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測(cè)等諸多領(lǐng)域。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的定量方法，在Real-time PCR中，模板定量有兩種策略，相對(duì)定量和定量。廣州微量RT-PCR檢測(cè)技術(shù)原理聚合酶鏈反應(yīng)為這些技術(shù)提供了大量的純DNA，有時(shí)是單鏈的。

Real-time PCR原理：基于探針的化學(xué)法，Real-time PCR應(yīng)用一個(gè)或多個(gè)熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；依賴(lài)熒光能量共振傳遞（FRET）檢測(cè)特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，單單檢測(cè)特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，DNA及RNA定量；基因表達(dá)驗(yàn)證；等位基因鑒別；SNP分型；病原體和病毒檢測(cè)；多重PCR，探針和目標(biāo)片段的特異性結(jié)合產(chǎn)生熒光信號(hào)，因此減少了背景熒光和假陽(yáng)性；探針可標(biāo)記不同波長(zhǎng)的熒光基團(tuán)，用于多重PCR反應(yīng)。對(duì)于不同的靶序列需要合成不同的探針，原料成本較高。

Real-time PCR鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶，不但操作煩瑣，而且價(jià)格昂貴，制約了PCR技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展。耐熱DNA聚合酶-Taq酶的發(fā)現(xiàn)對(duì)于PCR的應(yīng)用有里程碑的意義，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個(gè)循環(huán)加酶，使PCR技術(shù)變得非常簡(jiǎn)捷、同時(shí)也降低了成本，PCR技術(shù)得以大量應(yīng)用，并逐步應(yīng)用于臨床。多重連接依賴(lài)探針擴(kuò)增允許用單個(gè)引物對(duì)擴(kuò)增多個(gè)靶標(biāo)，從而避免多重PCR的分辨率限制。引物的設(shè)計(jì)注意事項(xiàng)：1，注意引物設(shè)計(jì)好后的產(chǎn)物長(zhǎng)度。Real-time PCR的較佳產(chǎn)物長(zhǎng)度在150-250kb左右（書(shū)上說(shuō)這樣可以增加熒光的敏感度，減少實(shí)驗(yàn)誤差，但是我對(duì)這個(gè)說(shuō)法持懷疑態(tài)度。產(chǎn)物長(zhǎng)度越大，SYBR嵌入的越多，這樣才能夠保證之后的熒光值比較可信）。2，不同的管家基因擴(kuò)增效率不同。所以在做整個(gè)實(shí)驗(yàn)之前應(yīng)該做一次檢測(cè)擴(kuò)增效率的實(shí)驗(yàn)。如果擴(kuò)增效率相差太大，就不能使用delt，deltCt法來(lái)比較基因表達(dá)量的高低。PCR反應(yīng)的很大特點(diǎn)是具有較大擴(kuò)增能力與極高的靈敏性。

聚合酶鏈反應(yīng)注意事項(xiàng)：在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在總RNA的提取過(guò)程中，注意避免mRNA的斷裂；為了防止非特異性擴(kuò)增，必須設(shè)陰性對(duì)照；內(nèi)參的設(shè)定主要為了用于靶RNA的定量。常用的內(nèi)參有G3PD（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）、β-Actin（β-肌動(dòng)蛋白）等。其目的在于避免RNA定量誤差、加樣誤差以及各PCR反應(yīng)體系中擴(kuò)增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差；PCR不能進(jìn)入平臺(tái)期，出現(xiàn)平臺(tái)效應(yīng)與所擴(kuò)增的目的基因的長(zhǎng)度、序列、二級(jí)結(jié)構(gòu)以及目標(biāo)DNA起始的數(shù)量有關(guān)。故對(duì)于每一個(gè)目標(biāo)序列出現(xiàn)平臺(tái)效應(yīng)的循環(huán)數(shù)，均應(yīng)通過(guò)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定；防止DNA的污染：采用DNA酶處理RNA；在可能的情況下，將PCR引物置于基因的不同外顯子，以消除基因和mRNA的共線(xiàn)性。聚合酶鏈反應(yīng)可以選擇這些突變來(lái)理解蛋白質(zhì)是如何完成其功能的，并改變或改善蛋白質(zhì)功能。Real-time PCR提高實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性。徐州骨頭熒光定量PCR服務(wù)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR通過(guò)內(nèi)參或者外參法對(duì)待測(cè)樣品中的特定DNA序列進(jìn)行定量分析的方法。廣州微量RT-PCR檢測(cè)技術(shù)原理

Real-time PCR螢光染料摻入法:在PCR反應(yīng)體系中，加入過(guò)量SYBR螢光染料，SYBR螢光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射螢光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何螢光信號(hào)，從而保證螢光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。此方法適用于：1、靈敏度高：使用SYBR可使螢光效果增強(qiáng)到1000倍以上。2、通用性好,不需要設(shè)計(jì)探針,方法簡(jiǎn)便,省時(shí),價(jià)格低廉。3、通用型方法，在國(guó)內(nèi)外科研中普遍使用。4、高通量大規(guī)模的定量PCR檢測(cè)。5、專(zhuān)一性要求不高的定量PCR檢測(cè)。廣州微量RT-PCR檢測(cè)技術(shù)原理

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