廣州實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的常見問題：靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其PCR擴(kuò)增是不會成功的。假陽性：出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高。引物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。需重新設(shè)計(jì)引物。出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶：PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對策有：減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。適當(dāng)降低Mg2+濃 度。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程。廣州實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理

聚合酶鏈反應(yīng)：流聚合酶鏈反應(yīng):一種偽等溫PCR方法。將溶液置于熱梯度下，而不是反復(fù)加熱和冷卻聚合酶鏈反應(yīng)混合物。由此產(chǎn)生的熱不穩(wěn)定性驅(qū)動對流流動自動將聚合酶鏈反應(yīng)試劑從熱區(qū)域和冷區(qū)域打亂，從而反復(fù)啟動聚合酶鏈反應(yīng)。通過利用混沌流場的出現(xiàn)，可以優(yōu)化熱邊界條件和PCR外殼的幾何形狀等參數(shù)，以產(chǎn)生特異和快速的PCR。這種對流聚合酶鏈反應(yīng)設(shè)置明顯降低了設(shè)備功率需求和操作時(shí)間。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)):用于從RNA中擴(kuò)增DNA。逆轉(zhuǎn)錄酶將核糖核酸逆轉(zhuǎn)錄成cDNA ，然后通過聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)較廣用于表達(dá)譜，以確定基因的表達(dá)或鑒定RNA轉(zhuǎn)錄物的序列，包括轉(zhuǎn)錄起始和終止位點(diǎn)。如果基因的基因組DNA序列是已知的，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)可以用來繪制基因中外顯子和內(nèi)含子的位置?；虻?’端(對應(yīng)于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn))通常通過 RACE-PCR (快速擴(kuò)增cDNA末端)中。深圳微量定量PCR原理聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的模板的取材主要依據(jù)PCR的擴(kuò)增對象，可以是病原體標(biāo)本如病毒、細(xì)菌、菌類等。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)又稱多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一項(xiàng)利用DNA雙鏈復(fù)制的原理，在生物體外復(fù)制特定DN段的核酸合成技術(shù)。透過這項(xiàng)技術(shù)，可在短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因，而不必依賴大腸桿菌或酵母菌等生物體。聚合酶鏈反應(yīng)是是一種簡單，廉價(jià)和可靠的方法復(fù)制DN段，這個(gè)概念適用于現(xiàn)物學(xué)和相關(guān)科學(xué)的許多領(lǐng)域。 PCR可能是分子生物學(xué)中使用很較廣的技術(shù)。這種技術(shù)被用于生物醫(yī)學(xué)研究，犯罪取證和分子考古學(xué)。通常，PCR由一系列20-40次重復(fù)的溫度變化組成，稱為熱循環(huán)，每個(gè)循環(huán)通常由兩個(gè)或三個(gè)離散的溫度步驟組成。

現(xiàn)在有些PCR因?yàn)閿U(kuò)增區(qū)很短，即使Taq酶活性不是很好也能在很短的時(shí)間內(nèi)復(fù)制完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時(shí)在60℃-65℃間進(jìn)行，以減少一次升降溫過程，提高了反應(yīng)速度。檢測：PCR反應(yīng)擴(kuò)增出了高的拷貝數(shù)，下一步檢測就成了關(guān)鍵。熒光素（溴化乙錠，EB）染色凝膠電泳是很常用的檢測手段。電泳法檢測特異性是不太高的，因此引物兩聚體等非特異性的雜交體很容易引起誤判。但因?yàn)槠浜喗菀仔?，成為了主流檢測方法。近年來以熒光探針為的檢測方法，有逐漸取代電泳法的趨勢。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中要確保反應(yīng)緩沖液融化完全并徹底混勻。

聚合酶鏈反應(yīng)：等位基因特異性聚合酶鏈反應(yīng):基于單核苷酸變異的診斷或克隆技術(shù)(snv不要與 SNPs 混淆)(患者的單堿基差異)。它需要事先知道DNA序列，包括等位基因之間的差異，并使用3’端包含SNV的引物(通常包含SNV周圍的堿基對緩沖液)。在模板和引物不匹配的情況下，嚴(yán)格條件下的PCR擴(kuò)增效率要低得多，因此用單核苷酸多態(tài)性特異性引物成功擴(kuò)增表明序列中存在特異性單核苷酸多態(tài)性。有關(guān)更多信息，請參見單核苷酸多態(tài)性基因分型。裝配聚合酶鏈反應(yīng)或者聚合酶循環(huán)組件:通過對具有短重疊片段的長寡核苷酸池進(jìn)行PCR來人工合成長DNA序列。寡核苷酸在有義和反義方向之間交替，重疊片段決定聚合酶鏈反應(yīng)片段的順序，從而選擇性地產(chǎn)生很終的長DNA產(chǎn)物。像所有酶一樣，DNA聚合酶也容易出錯(cuò)，這反過來會導(dǎo)致產(chǎn)生的PCR片段發(fā)生突變。南京分子生物學(xué)PCR檢測技術(shù)技術(shù)服務(wù)

熱啟動聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)可以通過將反應(yīng)組分加熱到變性溫度在加入聚合酶之前。廣州實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的常見問題：PCR產(chǎn)物的電泳檢測時(shí)間一般為48h以內(nèi)，有些很好于當(dāng)日電泳檢測，大于48h后帶型不規(guī)則甚至消失。假陰性：不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶。PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有模板核酸的制備，引物的質(zhì)量與特異性，酶的質(zhì)量及溴乙錠的使用， PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。模板：模板中含有雜蛋白質(zhì)，模板中含有Taq酶抑制劑，模板中蛋白質(zhì)沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，在提取制備模板時(shí)丟失過多，或吸入酚。模板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng) 固定不宜隨意更改。廣州實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理