蘇州分子生物學(xué)Real-time PCR方案

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)準(zhǔn)備：PCR所用的酶主要有兩種來(lái)源：Taq和Pfu，分別來(lái)自兩種不同的噬熱菌。其中Taq擴(kuò)增效率高但易發(fā)生錯(cuò)配。Pfu擴(kuò)增效率弱但有糾錯(cuò)功能。所以實(shí)際使用時(shí)根據(jù)需要必須做不同的選擇。模板即擴(kuò)增用的DNA，可以是任何來(lái)源，但有兩個(gè)原則，純度必須較高，第二濃度不能太高以免抑制。緩沖液的成分很為復(fù)雜，除水外一般包括四個(gè)有效成分：緩沖體系，一般使用HEPES或MOPS緩沖體系；一價(jià)陽(yáng)離子，一般采用鉀離子，但在特殊情況下也可使用銨根離子；二價(jià)陽(yáng)離子，即鎂離子，根據(jù)反應(yīng)體系確定，除特殊情況外不需調(diào)整；輔助成分，常見的有DMSO、甘油等，主要用來(lái)保持酶的活性和幫助DNA解除纏繞結(jié)構(gòu)。聚合酶鏈反應(yīng)應(yīng)經(jīng)常使用帶有一次性柱塞和超長(zhǎng)移液器吸頭的移液器。蘇州分子生物學(xué)Real-time PCR方案

聚合酶鏈反應(yīng)允許快速生產(chǎn)短DN段，即使已知的引物序列不超過兩個(gè)。聚合酶鏈反應(yīng)的這種能力增強(qiáng)了許多方法，例如生成雜交 探針用于 Southern 或northern blot 雜交。聚合酶鏈反應(yīng)為這些技術(shù)提供了大量的純DNA，有時(shí)是單鏈的，甚至可以從非常少量的起始材料中進(jìn)行分析。脫氧核糖核酸測(cè)序的任務(wù)也可以通過聚合酶鏈反應(yīng)來(lái)輔助完成。已知的DN段可以很容易地從患有遺傳疾病突變的患者體內(nèi)產(chǎn)生。對(duì)擴(kuò)增技術(shù)的修飾可以從完全未知的基因組中提取片段，或者可以產(chǎn)生感興趣區(qū)域的單鏈。聚合酶鏈反應(yīng)有許多應(yīng)用于傳統(tǒng)的 DNA克隆。它可以從更大的基因組中提取片段以插入載體，這可能只有少量可用。使用一組“載體引物”，它還可以分析或提取已經(jīng)插入載體的片段。聚合酶鏈反應(yīng)方案的一些改變可以產(chǎn)生突變(通用的或定點(diǎn)的)插入片段。徐州實(shí)時(shí)定量PCR序列間特異性聚合酶鏈反應(yīng)放大簡(jiǎn)單重復(fù)序列之間的區(qū)域，以產(chǎn)生擴(kuò)增片段長(zhǎng)度的獨(dú)特指紋。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的常見問題：靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其PCR擴(kuò)增是不會(huì)成功的。假陽(yáng)性：出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高。引物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。需重新設(shè)計(jì)引物。出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶：PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對(duì)策有：減少酶量，或調(diào)換另一來(lái)源的酶。②減少dNTP的濃度。適當(dāng)降低Mg2+濃 度。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。

industryTemplate嵌套式PCR在特異性擴(kuò)增長(zhǎng)DN段方面通常比傳統(tǒng)PCR更成功，但它需要更詳細(xì)的目標(biāo)序列知識(shí)。

聚合酶鏈反應(yīng)的常見問題分析與解決方法：無(wú)擴(kuò)增條帶：酶失活或在反應(yīng)體系中未加入酶。Taq DNA聚合酶因保存或運(yùn)輸不當(dāng)而失活，往往通過更換新酶或用另一來(lái)源的酶以獲得滿意的結(jié)果。模板含有雜質(zhì)。特別是對(duì)甲醛固定及石蠟包埋的組織常含甲酸，造成DNA脫嘌呤而影響PCR的結(jié)果。變性溫度是否準(zhǔn)確：PCR儀指示溫度與實(shí)際溫度是否相符，過高酶在前幾個(gè)循環(huán)就迅速失活；過低則模板變性不徹底。反應(yīng)系統(tǒng)中污染了蛋白酶及核酸酶，應(yīng)在未加Taq酶以前，將反應(yīng)體系95℃加熱5-10 min。引物變質(zhì)失效。人工合成的引物是否正確。是否純化，或因儲(chǔ)存條件不當(dāng)而失活。引物錯(cuò)誤。利用BLAST檢查引物特異性或重新設(shè)計(jì)引物。 DNA凝膠電泳時(shí)加入陽(yáng)性對(duì)照，確保不是DNA凝膠和PCR程序的問題。聚合酶鏈反應(yīng)五要素：參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即：引物、酶、dNTP、模板和緩沖液。廈門組織熒光定量PCR

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的模板的取材主要依據(jù)PCR的擴(kuò)增對(duì)象，可以是病原體標(biāo)本如病毒、細(xì)菌、菌類等。蘇州分子生物學(xué)Real-time PCR方案

PCR的反應(yīng)條件：Tm=4（G+c）+（A+T），一般在45～55度，溫度低容易退火但特異性低；溫度高，不容易退火但特異性高。退火時(shí)間30秒。延伸溫度一般在70～75度這時(shí)TaqDNA聚合酶活性很高（150個(gè)/S），當(dāng)引物在16個(gè)堿基以下時(shí)可采用緩慢升高溫度到70～75度的方法，使在低溫下就開始合成。一般<1KB時(shí)間1分鐘即可。當(dāng)〈1KB時(shí)在較后的循環(huán)中延長(zhǎng)擴(kuò)增時(shí)間。循環(huán)次數(shù)25～30次。無(wú)產(chǎn)物時(shí)：取10ul擴(kuò)增混合液作模板在進(jìn)行PCR擴(kuò)增；增加TaqDNA聚合酶濃度；增加循環(huán)次數(shù)；降低退火溫度；加靶DNA量。蘇州分子生物學(xué)Real-time PCR方案