杭州分子生物學(xué)RT-PCR檢測(cè)技術(shù)原理及步驟

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的循環(huán)參數(shù)：預(yù)變性，模板DNA完全變性與PCR酶的完全對(duì)PCR能否成功至關(guān)重要，建議加熱時(shí)間參考試劑說明書，一般未修飾的Taq酶時(shí)間為兩分鐘。變性步驟，循環(huán)中一般95℃，30秒足以使各種靶DNA序列完全變性，可能的情況下可縮短該步驟時(shí)間。變性時(shí)間過長損害酶活性，過短靶序列變性不徹底，易造成擴(kuò)增失敗。引物退火，退火溫度需要從多方面去決定，一般根據(jù)引物的Tm值為參考，根據(jù)擴(kuò)增的長度適當(dāng)下調(diào)作為退火溫度。然后在此次實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上做出預(yù)估。退火溫度對(duì)PCR的特異性有較大影響。引物延伸，引物延伸一般在72℃進(jìn)行（Taq酶很適溫度）。但在擴(kuò)增長度較短且退火溫度較高時(shí)，本步驟可省略延伸時(shí)間隨擴(kuò)增片段長短而定，一般推薦在1000bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生設(shè)定為1min/kbp。循環(huán)數(shù)，大多數(shù)PCR含25-35循環(huán)，過多易產(chǎn)生非特異擴(kuò)增。延伸，在一個(gè)循環(huán)后，反應(yīng)在72℃維持10-30分鐘．使引物延伸完全，并使單鏈產(chǎn)物退火成雙鏈。PCR的很大特點(diǎn)是能將微量的DNA大幅增加。杭州分子生物學(xué)RT-PCR檢測(cè)技術(shù)原理及步驟

基于聚合酶鏈反應(yīng)的遺傳(或脫氧核糖核酸)指紋圖譜協(xié)議的發(fā)展已在法醫(yī)學(xué)中得到較廣應(yīng)用：遺傳指紋以其辨別力的形式，可以從世界上所有人群中獨(dú)特地區(qū)分任何一個(gè)人。微小的DNA樣本可以從犯罪現(xiàn)場(chǎng)，和比較的從嫌疑人那里，或者從DNA資料庫早期的證據(jù)或罪犯。這些測(cè)試的簡單版本通常用于在刑事調(diào)查中快速排除嫌疑人。幾十年前的犯罪證據(jù)可以被檢驗(yàn)，確認(rèn)或免責(zé)很初被定罪的人。脫氧核糖核酸指紋中較小的區(qū)別有助于親子鑒定，在親子鑒定中，一個(gè)人和他的近親相匹配?？梢詼y(cè)試未知人類遺骸的DNA，并與可能的父母、兄弟姐妹或兒童進(jìn)行比較。類似的測(cè)試可以用來確認(rèn)被收養(yǎng)(或)孩子的親生父母。新生兒的實(shí)際生父也可以被確認(rèn)(或排除)。廈門組織數(shù)字PCR設(shè)計(jì)公司聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)準(zhǔn)備：引物內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)互補(bǔ)序列。

聚合酶鏈反應(yīng)也可以用作以下敏感試驗(yàn)的一部分組織分型，對(duì)移植至關(guān)重要。截至2008年，甚至有人提議用聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)取代傳統(tǒng)的血型抗體檢測(cè)。許多形式的病癥涉及致病基因的改變。通過使用基于聚合酶鏈反應(yīng)的測(cè)試來研究這些突變，醫(yī)治方案有時(shí)可以根據(jù)患者的不同而不同。聚合酶鏈反應(yīng)可以早期診斷惡性疾病，如白血病和淋巴瘤，這是目前病癥研究中發(fā)展很快的，并且已經(jīng)被常規(guī)使用。PCR檢測(cè)可以直接在基因組DNA樣品上進(jìn)行，以檢測(cè)易位特異性惡性細(xì)胞，其靈敏度至少是其他方法的10，000倍。聚合酶鏈反應(yīng)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域非常有用，因?yàn)樗试S分離和擴(kuò)增病癥抑制劑。例如，定量PCR可以用于量化和分析單細(xì)胞，以及識(shí)別DNA、mRNA和蛋白質(zhì)的確認(rèn)和組合。

聚合酶鏈反應(yīng)：等位基因特異性聚合酶鏈反應(yīng):基于單核苷酸變異的診斷或克隆技術(shù)(snv不要與 SNPs 混淆)(患者的單堿基差異)。它需要事先知道DNA序列，包括等位基因之間的差異，并使用3’端包含SNV的引物(通常包含SNV周圍的堿基對(duì)緩沖液)。在模板和引物不匹配的情況下，嚴(yán)格條件下的PCR擴(kuò)增效率要低得多，因此用單核苷酸多態(tài)性特異性引物成功擴(kuò)增表明序列中存在特異性單核苷酸多態(tài)性。有關(guān)更多信息，請(qǐng)參見單核苷酸多態(tài)性基因分型。裝配聚合酶鏈反應(yīng)或者聚合酶循環(huán)組件:通過對(duì)具有短重疊片段的長寡核苷酸池進(jìn)行PCR來人工合成長DNA序列。寡核苷酸在有義和反義方向之間交替，重疊片段決定聚合酶鏈反應(yīng)片段的順序，從而選擇性地產(chǎn)生很終的長DNA產(chǎn)物。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的特點(diǎn)：特異性強(qiáng)，PCR反應(yīng)的特異性決定因素為：引物與模板DNA特異正確的結(jié)合；堿基配對(duì)原則；Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性；靶基因的特異性與保守性。其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵。引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對(duì)原則的。聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性及TaqDNA聚合酶耐高溫性，使反應(yīng)中模板與引物的結(jié)合（復(fù)性）可以在較高的溫度下進(jìn)行，結(jié)合的特異性增加，被擴(kuò)增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng))：用于從RNA中擴(kuò)增DNA。莆田血液Real-time PCR原理

多重連接依賴探針擴(kuò)增允許用單個(gè)引物對(duì)擴(kuò)增多個(gè)靶標(biāo)，從而避免多重PCR的分辨率限制。杭州分子生物學(xué)RT-PCR檢測(cè)技術(shù)原理及步驟

聚合酶鏈反應(yīng)的常見問題分析與解決方法：擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)多條帶(雜帶)：引物用量偏大，引物的特異性不高。應(yīng)調(diào)換引物或降低引物的使用量。循環(huán)的次數(shù)過多。適當(dāng)增加模板的量，減少循環(huán)次數(shù)。酶的用量偏高或酶的質(zhì)量不好，應(yīng)降低酶量或調(diào)換另一來源的酶。退火溫度偏低，退火及延伸時(shí)間偏長。應(yīng)提高退火溫度，減少變性與延伸時(shí)間，也可采用二種溫度的PCR擴(kuò)增。以2度為梯度設(shè)計(jì)梯度PCR反應(yīng)優(yōu)化退火溫度。 樣品處理不當(dāng)。Mg2+濃度偏高，因適當(dāng)調(diào)整Mg2+使用濃度。若為PCR試劑盒，也可能時(shí)試劑盒本身質(zhì)量有問題。復(fù)制提前終止。使用非熱啟動(dòng)的聚合酶時(shí)常有發(fā)生。冰上準(zhǔn)備反應(yīng)體系或采用熱啟動(dòng)聚合酶。杭州分子生物學(xué)RT-PCR檢測(cè)技術(shù)原理及步驟