干貨：外泌體研究實(shí)操中的常見(jiàn)問(wèn)題解答

Umibio 產(chǎn)品：UR52121 /UR52120 外泌體提取純化試劑盒（細(xì)胞上清）

Q：如何增加外泌體試劑盒的提取效率？

A：首先，樣品準(zhǔn)備階段確保樣品的質(zhì)量和數(shù)量充足；在提取階段，加入ECS試劑后可以通過(guò)增加靜置時(shí)間來(lái)提高提取效率，但同時(shí)也可能影響到純度，因此靜置時(shí)間也需要適當(dāng)控制，初次實(shí)驗(yàn)可以考慮靜置過(guò)夜。

Q：離心后無(wú)法看到沉淀如何處理？

A：樣品中的外泌體是微量的存在，離心后無(wú)法看到沉淀屬于正?，F(xiàn)象。建議離心后用PBS重懸沉淀時(shí)不僅洗脫肉眼可見(jiàn)的沉淀部位，還要吹洗離心管外側(cè)靠近底部的狹長(zhǎng)區(qū)域，具體位置根據(jù)離心機(jī)傾斜角度決定。建議在下次樣品準(zhǔn)備階段確保樣品的質(zhì)量和數(shù)量充足，干細(xì)胞/原代細(xì)胞上清可在提取前采用超濾管（100KD）濃縮3~5倍后再提取。

Q：使用EPF柱時(shí)堵塞如何處理？

A：過(guò)濾柱的孔徑在220nm左右。如果出現(xiàn)堵塞情況，可以將柱子旋轉(zhuǎn)180度再次離心。若上室還有殘留液體，需要使用新的EPF柱，該柱子可以單獨(dú)購(gòu)買（產(chǎn)品貨號(hào)UR90102）。

Q：沉淀法的具體原理是什么？

A：將高親水性聚合物（聚乙二醇等）添加到含外泌體的溶液中后，外泌體周圍的水分子被聚合物束縛，降低了外泌體的溶解度并誘導(dǎo)其隨后的沉淀，使外泌體在低速離心下可以很容易沉淀。

Q：開(kāi)封后的ECS試劑有沉淀出現(xiàn)是否可以繼續(xù)使用？

A：沉淀物如果是結(jié)晶狀，建議56度水浴搖晃混勻。如果結(jié)晶消失，則可以繼續(xù)使用，少量沉淀不影響提取效果。

Umibio 產(chǎn)品：UR52146/UR52149外泌體提取試劑盒（乳液）

Q：乳液提取試劑盒加solution B之后無(wú)豆花狀固體，此時(shí)是否可以繼續(xù)實(shí)驗(yàn)？

A：不可以，必須在明確看到豆花狀沉淀，溶液變透明后才可進(jìn)行下一步操作。此時(shí)需要繼續(xù)加入適量solution B，并在37度水浴加熱，直至看到豆花狀沉淀。

Umibio 產(chǎn)品：UR52151/UR52150外泌體提取純化試劑盒（血液）升級(jí)版

Q：試劑盒UR52151與UR52136有哪些不同？

A：試劑盒UR52151相較UR52136增加了去雜蛋白環(huán)節(jié)，提升了外泌體的純度，相應(yīng)得率會(huì)有所下降。血清樣品蛋白含量很高，沉淀法試劑盒無(wú)法實(shí)現(xiàn)完全分離（兩款均是），不建議做外泌體陰性蛋白（如calnexin）檢測(cè)。

Q：如何選擇血清和血漿樣本來(lái)進(jìn)行外泌體研究？

A：血清和血漿都是常見(jiàn)的外泌體樣本來(lái)源。由于血液在凝血過(guò)程中血小板會(huì)受到刺激會(huì)產(chǎn)生大量外泌體，因此若需要排除血小板外泌體的影響應(yīng)采用血漿進(jìn)行外泌體提取檢測(cè)。

Q：出現(xiàn)溶血現(xiàn)象的血清/血漿樣本對(duì)外泌體提取有什么影響？

A：破碎的細(xì)胞會(huì)釋放一些雜質(zhì)影響下游實(shí)驗(yàn)，尤其是電鏡鑒定。溶血樣品里的外泌體也會(huì)降解。溶血樣品不建議用于外泌體提取。

Q：試劑盒可以提取多少血清/血漿樣本的外泌體？

A：該試劑盒一共可以提取20個(gè)樣本的外泌體，每個(gè)樣本最大體積為1mL。建議使用0.5mL體系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在EPF柱純化外泌體階段再進(jìn)行樣本合并。

Umibio 產(chǎn)品：UR52161/UR52160外泌體提取純化試劑盒（組織）

Q：組織提取試劑盒如何提高得率？

A：加入solutionA2后可以增加消化時(shí)間，不超過(guò)1小時(shí)；加入solutionB2后可以增加靜置時(shí)間，不超過(guò)1小時(shí)。

Umibio 產(chǎn)品：UR52301 外泌體 CD63&TSG101蛋白檢測(cè)試劑盒

Q：Western Blot報(bào)告中PC條帶是何種蛋白？

A：PC是系統(tǒng)樣品，用于指示本次Western Blot檢測(cè)系統(tǒng)是否正常工作。如果PC有條帶，目的樣品無(wú)條帶，說(shuō)明目的樣品的目的蛋白豐度很低；如果PC也無(wú)條帶，則說(shuō)明本次實(shí)驗(yàn)體系存在問(wèn)題。

Q：外泌體蛋白質(zhì)標(biāo)記物為何會(huì)有兩條條帶？

A：在不同的樣品中檢測(cè)到的蛋白條帶大小和帶數(shù)存在差異是正常現(xiàn)象。膜蛋白由于修飾剪切等緣故，可能會(huì)出現(xiàn)多條帶的狀況；不同細(xì)胞中修飾剪切等情況不一定相同，因此相同蛋白在不同樣品中檢出的條帶表現(xiàn)可能不同屬于正常情況。

Q：CD63是一個(gè)多次跨膜蛋白，煮樣可能導(dǎo)致蛋白聚集，應(yīng)該如何判斷是否煮樣？

A：建議CD63進(jìn)行煮樣，溫度控制在70度，時(shí)間為10min。

Umibio 產(chǎn)品：UR52302/UR52303 外泌體紅色熒光標(biāo)記染料（PKH26/PKH67）

1、建議用于染料標(biāo)記的外泌體原始濃度達(dá)到0.5~1μg/μL。外泌體濃度過(guò)低實(shí)驗(yàn)失敗風(fēng)險(xiǎn)較高。

2、外泌體染色步驟中去除游離染料的第4、5步必不可少，以避免游離染料對(duì)后期實(shí)驗(yàn)的干擾。這一步相當(dāng)于重新提取外泌體，所有外泌體提取純化方式都適用。

3、去除游離染料的方法推薦選擇3~10KD的超濾管，利用其置換溶劑功能去除游離染料。具體步驟和實(shí)驗(yàn)參數(shù)請(qǐng)咨詢超濾管廠商。

4、染料標(biāo)記外泌體與細(xì)胞共孵育的培養(yǎng)條件盡可能使用無(wú)血清培養(yǎng)基，以提高細(xì)胞對(duì)染料標(biāo)記外泌體的攝取效率，共孵育參考時(shí)長(zhǎng)為2小時(shí)。

5、本染料也可用于細(xì)胞膜染色，參考劑量染料濃度為2X10–6 M，細(xì)胞濃度為1X107 cells/mL。

6、基于以下兩個(gè)原因，建議準(zhǔn)備2倍于正常共孵育實(shí)驗(yàn)所需外泌體的量來(lái)進(jìn)行染料標(biāo)記。一是使用過(guò)量染料進(jìn)行標(biāo)記，外泌體的染色效率仍無(wú)法達(dá)到100%；二是去除游離染料的過(guò)程中存在外泌體回收率的損失。

Umibio 產(chǎn)品：UR21017 外泌體熒光染料（DIR）

1、活體成像對(duì)外泌體濃度要求較高，建議用于染料標(biāo)記的外泌體原始濃度達(dá)到0.5~1.5μg/μL，外泌體濃度過(guò)低實(shí)驗(yàn)失敗風(fēng)險(xiǎn)較高。

2、外泌體染色步驟中去除游離染料的第4、5步必不可少，以避免游離染料對(duì)后期實(shí)驗(yàn)的干擾。這一步相當(dāng)于重新提取外泌體，所有外泌體提取純化方式都適用。

3、去除游離染料的方法推薦選擇3~10KD的超濾管，利用其置換溶劑功能去除游離染料。具體步驟和實(shí)驗(yàn)參數(shù)請(qǐng)咨詢超濾管廠商。

4、DiR碘化物（DiR染料）的發(fā)射波長(zhǎng)肉眼不可見(jiàn)，需要使用配備CCD鏡頭或其他設(shè)備的近紅外檢測(cè)儀器，建議使用活體成像儀。

5、建議染料標(biāo)記的外泌體在注射后24h內(nèi)設(shè)置梯度時(shí)間進(jìn)行觀測(cè)，多數(shù)情況注射后2-8小時(shí)熒光強(qiáng)度達(dá)到峰值。為保證觀察結(jié)果，小動(dòng)物需要做剃毛處理。

6、基于以下兩個(gè)原因，建議準(zhǔn)備2倍于正?；铙w成像和示蹤實(shí)驗(yàn)所需外泌體的量來(lái)進(jìn)行染料標(biāo)記。一是使用過(guò)量染料進(jìn)行標(biāo)記，外泌體的染色效率仍無(wú)法達(dá)到100%；二是去除游離染料的過(guò)程中存在外泌體回收率的損失。

Umibio 產(chǎn)品：UR32061 miRNA 加尾法逆轉(zhuǎn)錄試劑盒

Q：外泌體miRNA qPCR實(shí)驗(yàn)選用哪個(gè)基因做內(nèi)參？

A：外泌體qPCR目前沒(méi)有公認(rèn)內(nèi)參基因，本公司檢測(cè)miRNA做的是外參。外參可以最大限度降低對(duì)定量實(shí)驗(yàn)造成的干擾，適用于內(nèi)參表達(dá)不穩(wěn)定的外泌體或暫未發(fā)現(xiàn)合適內(nèi)參的其他樣品，對(duì)目的microRNA進(jìn)行相對(duì)定量，替代內(nèi)參作用。部分文獻(xiàn)也會(huì)選取U6等作為內(nèi)參，可以參考對(duì)應(yīng)文章。

Umibio產(chǎn)品：UR32071/UR32070 /UR32081/UR32080 2×SYBR Green qPCR 試劑（預(yù)混 ROX1型&預(yù)混 ROX2 型）

Q：下游qPCR檢測(cè)時(shí)CT值過(guò)高如何處理？

A：外泌體RNA是微量的存在，首先樣品準(zhǔn)備階段確保樣品的質(zhì)量和數(shù)量充足（例如血清建議新鮮樣本準(zhǔn)備2ml以上）。有實(shí)驗(yàn)表明，2ml血清樣本提取的外泌體，qPCR檢測(cè)U6（細(xì)胞樣本microRNA內(nèi)參）的CT值只有30+，目標(biāo)基因CT值在30+~40+。CT值通常qPCR結(jié)果在30以上默認(rèn)為不表達(dá)，但外泌體比較特殊，可適當(dāng)放寬標(biāo)準(zhǔn)。

Q：外泌體qPCR實(shí)驗(yàn)如何使用內(nèi)參？

A：外泌體沒(méi)有公認(rèn)內(nèi)參，常規(guī)內(nèi)參基因在外泌體中表達(dá)量甚至可能比目標(biāo)基因還低。外參是在沒(méi)有合適內(nèi)參的情況下的替代物。microRNA 檢測(cè)外參是化學(xué)合成的線蟲(chóng)短片段單鏈 RNA (cel-miR-39-3p) mimics，經(jīng)檢測(cè)在人類、小鼠、大鼠中均無(wú)同源片段，最大限度降低了對(duì)定量實(shí)驗(yàn)造成的干擾，適用于內(nèi)參表達(dá)不穩(wěn)定的外泌體或暫未發(fā)現(xiàn)合適內(nèi)參的其他樣品，對(duì)目的 microRNA 進(jìn)行相對(duì)定量。

外參序列：ucaccggguguaaaucagcuug；

cel-miR-39-3p 外參正序列：AACACGCTCACCGGGTGTAA。

Q：國(guó)產(chǎn)儀器應(yīng)該選擇哪款qPCR試劑盒？

A：多數(shù)國(guó)產(chǎn)儀器可以不用ROX校準(zhǔn)，所以推薦用低濃度的ROX2試劑盒。具體型號(hào)可以咨詢我司。

Umibio 產(chǎn)品：UR21021 外泌體 GW4869抑制劑

Q：M指的是什么單位？

A：M指的是體積摩爾濃度，mol/L。

Q：GW4869的溶劑是什么？

A：DMSO。

Umibio 產(chǎn)品：UR51102/ UR51101 外泌體專用培養(yǎng)基

Q：外泌體專用培養(yǎng)基是否可用于重懸、接種以及繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞？

A：不可以。外泌體專用培養(yǎng)基不含促細(xì)胞貼壁的因子，可以維持已貼壁的細(xì)胞一定時(shí)間內(nèi)的生長(zhǎng)，無(wú)法替代完全培養(yǎng)基長(zhǎng)期培養(yǎng)細(xì)胞。

Q：外泌體專用培養(yǎng)基有哪些成分？

A：產(chǎn)品含有 HEPES，L-Glutamine, Pharm Grade Albumin, Hypoxanthine, Thymidine, Phenol Red, Glucose（偏低糖2g/L）. 無(wú)動(dòng)物源Xeno-free, Serum-free.不含生長(zhǎng)因子（Growth factors），細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中無(wú)需添加血清即可達(dá)到完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)狀態(tài)。

Umibio 產(chǎn)品：UR51121/UR51120 外泌體專用間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基

Q：干細(xì)胞在更換外泌體專用間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基的過(guò)程中，遇到干細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，甚至死亡的現(xiàn)象，該如何處理？

A：干細(xì)胞在更換培養(yǎng)基的過(guò)程中，對(duì)于培養(yǎng)環(huán)境比較敏感，尤其是從高營(yíng)養(yǎng)環(huán)境（血清/HPL添加培養(yǎng)基）更換到低營(yíng)養(yǎng)環(huán)境（化學(xué)成分確定培養(yǎng)基）的過(guò)程中會(huì)遇到干細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，甚至死亡的現(xiàn)象，這些都是更換培養(yǎng)體系過(guò)程中經(jīng)常遇到的問(wèn)題。

解決方案1：提高更換培養(yǎng)基時(shí)干細(xì)胞的融合度。細(xì)胞融合度從說(shuō)明書(shū)中20%提高到50%-60%時(shí)，然后更換外泌體專用間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基，然后在細(xì)胞融合度70%-80%以上時(shí)收集細(xì)胞上清液。

解決方案2：采用的是培養(yǎng)基逐步替換的方法。逐步減少原干細(xì)胞培養(yǎng)基的用量和逐步增加外泌體專用間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基的用量，在干細(xì)胞融合度20%時(shí)，吸取一半的原始培養(yǎng)基，加入一半的外泌體專用間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基，細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后，再替換為完全的外泌體專用間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基的進(jìn)行培養(yǎng)。

Umibio 產(chǎn)品：UR52031/UR51032/UR51039LipoP30轉(zhuǎn)染試劑

Q：lipo30進(jìn)行siRNA的轉(zhuǎn)染步驟有無(wú)特殊要求？

A：在共轉(zhuǎn)染混合物中添增強(qiáng)劑是為了促進(jìn)質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)染，它對(duì)siRNA的轉(zhuǎn)染沒(méi)有效果，因此在單獨(dú)進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染時(shí)無(wú)需在轉(zhuǎn)染混合物中添加（即第2步在稀釋 siRNA 時(shí)不要加入LipoP30-A試劑）。

Q：lipo30進(jìn)行不同種類核酸轉(zhuǎn)染時(shí)有何不同要求？

A：對(duì)于未經(jīng)修飾的siRNA、Silencer siRNA、Stealth RNAi siRNA、Silencer Select siRNA、Ambion Pre-miR前體、mirVana miRNA 模擬物、Ambion Anti-miR 抑制劑與mirVana miRNA抑制劑而言，只需使用B試劑即可有效遞送至胞漿。此時(shí)無(wú)需使用A試劑。

對(duì)于質(zhì)粒DNA、基于載體的BLOCK-iT shRNA或miRNA、ViraPower HiPerform慢病毒表達(dá)載體，或GeneArt CRISPR核酸酶載體而言，B試劑需與A試劑聯(lián)用以確保高效的細(xì)胞核遞送效果。