美國全自動膜片鉗電壓鉗制

膜片鉗技術與其它技術相結(jié)合Neher等**將膜片鉗技術與Fura2熒光測鈣技術結(jié)合，同時進行如細胞內(nèi)熒光強度、細胞膜離子通道電流及細胞膜電容等多指標變化的快速交替測定，這樣便可得出同一事件過程中，多種因素各自的變化情況，進而可分析這些變化間的相互關系。Neher將可光解出鈣離子的鈣螯合物引入膜片鉗技術，進而可以定量研究鈣離子濃度與分泌率的關系及比較大分泌率等指標。他又創(chuàng)膜片鉗的膜電容檢測與碳纖電極電化學檢測聯(lián)合運用的技術。之后又將光電聯(lián)合檢測技術與碳纖電極電化學檢測技術首先結(jié)合起來。這種結(jié)合既能研究分泌機制，又能鑒別分泌物質(zhì)，還能互相彌補各單種方法的不足。Eberwine等于1991年首先將膜片鉗技術與RT-PCR技術結(jié)合起來運用，可對形態(tài)相似而電活動不同的結(jié)果作出分子水平的解釋，從此開始了膜片鉗與分子生物學技術相結(jié)合的時代∶基因重組技術，膜通道蛋白重建技術。Neher創(chuàng)膜片鉗的膜電容檢測與碳纖電極電化學檢測聯(lián)合運用的技術。美國全自動膜片鉗電壓鉗制

膜片鉗技術是神經(jīng)科學領域非常重要的一項技術，1976年由國馬普生物物理研究所Neher和Sakmann發(fā)明，從而在活細胞上記錄到單個離子通道的電流。近半個世紀來，膜片鉗技術已經(jīng)成為神經(jīng)科學領域較常用也是較實用的技術之一，具有極大的精確性和靈活性，能夠揭示離子通道，單細胞突觸反應，及神經(jīng)環(huán)路連接等多層次的電生理特性。做過膜片鉗的人都知道，膜片鉗的信號采集設備一般由前置放大器，放大器，模數(shù)/數(shù)模轉(zhuǎn)換器等構(gòu)成，神經(jīng)元電信號先通過前置放大器（headstage）初步放大，后傳輸入放大器進一步放大，再傳入模數(shù)轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號，后被計算機采集。下圖顯示的是我們較常使用的AXON和HEKA膜片鉗的一個信號傳輸路徑。日本全自動膜片鉗研究膜片鉗技術實現(xiàn)了小片膜的孤立和高阻封接的形成，增寬了記錄頻帶范圍，提高了分辨率。

膜片鉗技術原理：膜片鉗技術是用玻璃微電極吸管把只含1-3個離子通道、面積為幾個平方微米的細胞膜通過負壓吸引封接起來（見右圖），由于電極前列與細胞膜的高阻封接，在電極前列籠罩下的那片膜事實上與膜的其他部分從電學上隔離，因此，此片膜內(nèi)開放所產(chǎn)生的電流流進玻璃吸管，用一個極為敏感的電流監(jiān)視器（膜片鉗放大器）測量此電流強度，就單一離子通道電流膜片鉗技術的建立，對生物學科學特別是神經(jīng)科學是一資有重大意義的變革。這是一種以記錄通過離子通道的離子電流來反映細胞膜單一的（或多個的離子通道分子活動的技術。些技術的出現(xiàn)自然將細胞水平和分子水平的生理學研究聯(lián)系在一起，同時又將神經(jīng)科學的不同分野必然地融匯在一起，改變了既往各個分野互不聯(lián)系、互不滲透，阻礙人們較全認識能力的弊端。這一技術的發(fā)現(xiàn)和基因克隆技術并架齊驅(qū)，給生命科學研究帶來了巨大的前進動力。

膜片鉗技術實現(xiàn)了小片膜的孤立和高阻封接的形成，由于高阻封接使背景噪聲水平降低，相對地增寬了記錄頻帶范圍，提高了分辨率。另外，它還具有良好的機械穩(wěn)定性和化學絕緣性。而小片膜的孤立使對單個離子通道進行研究成為可能。單通道電流1.典型的單通道電流呈一種振幅相同而持續(xù)時間不等的脈沖樣變化。他有兩個電導水平，即O和1，分別對應通道的關閉和開效狀態(tài)。2.有的矩形脈沖簇狀發(fā)放時，通道電流不在同一水平，可以明顯觀察到不同數(shù)目離子通道所形成的電流臺階，從而可推斷出被測膜片的通道數(shù)目。3.有的通道可記錄到圓滑型和方波形兩種形式。4.有些通道開放活動是持續(xù)開放，中間被閃動樣的關閉所中斷，形成burst開放。有些通道開放活動是簇狀開放與短期平靜交替出現(xiàn)，形成簇狀發(fā)放串（Cluster）離子和離子通道是細胞興奮的基礎，亦即產(chǎn)生生物電信號的基礎，生物電信號通常用電學或電子學方法進行測量。

膜片鉗技術發(fā)展至今，已經(jīng)成為現(xiàn)代細胞電生理的常規(guī)方法，它不僅可以作為基礎生物醫(yī)學研究的工具，而且直接或間接為臨床醫(yī)學研究服務。目前膜片鉗技術廣泛應用于神經(jīng)（腦）科學、心血管科學、藥理學、細胞生物學、病理生理學、中醫(yī)藥學、植物細胞生理學、運動生理等多學科領域研究。隨著全自動膜片鉗技術（Automaticpatchclamptechnology）的出現(xiàn)，膜片鉗技術因其具有的自動化、高通量特性，在藥物研發(fā)、藥物篩選中顯示了強勁的生命力。由于電極前列與細胞膜的高阻封接，在電極前列籠罩下的那片膜事實上與膜的其他部分從電學上隔離。美國全自動膜片鉗電壓鉗制

對離子通道功能的研究，主要采用記錄離子通道電流來間接反映離子通道功能。美國全自動膜片鉗電壓鉗制

離子通道結(jié)構(gòu)研究∶目前，絕大多數(shù)離子通道的一級結(jié)構(gòu)得到了闡明但根本的還是要搞清楚各種離子通道的三維結(jié)構(gòu)，在這方面，美國的二位科學家彼得·阿格雷和羅德里克麥金農(nóng)做出了一些開創(chuàng)性的工作，他們到用X光繞射方法得到了K離子通道的三維結(jié)構(gòu)，二位因此獲得2003年諾貝系化學獎。有關離子通道結(jié)構(gòu)不是本PPT的重點，可參考楊寶峰的<離子通道藥理學>和Hill的<lonicChannelsOfExcitableMembranes》。對離子通道功能的研究，主要采用記錄離子通道電流來間接反映離子通道功能，目前有如下兩種技術：電壓鉗技術（VoltageClamp），膜片鉗（patchclamp）技術。美國全自動膜片鉗電壓鉗制

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