在體多光子顯微鏡實驗

對于雙光子成像而言，離焦和近表面熒光激發(fā)是兩個比較大的深度限制因素，而對于三光子成像這兩個問題大大減小，但是三光子成像由于熒光團的吸收截面比2P要小得多，所以需要更高數(shù)量級的脈沖能量才能獲得與2P激發(fā)的相同強度的熒光信號。功能性3P顯微鏡比結構性3P顯微鏡的要求更高，它需要更快速的掃描，以便及時采樣神經元活動；需要更高的脈沖能量，以便在每個像素停留時間內收集足夠的信號。復雜的行為通常涉及到大型的大腦神經網絡，該網絡既具有局部的連接又具有遠程的連接。要想將神經元活動與行為聯(lián)系起來，需要同時監(jiān)控非常龐大且分布普遍的神經元的活動，大腦中的神經網絡會在幾十毫秒內處理傳入的刺激，要想了解這種快速的神經元動力學，就需要MPM具備對神經元進行快速成像的能力?？焖費PM方法可分為單束掃描技術和多束掃描技術。多光子顯微鏡被認為是、完整生物組織成像的手段之一，其成像尺度從分子級別到整個有機體。在體多光子顯微鏡實驗

使用MPM對神經元進行成像時，通過隨機訪問掃描—即激光束在整個視場上的任意選定點上進行快速掃描—可以只掃描感興趣的神經元，這樣不僅避免掃描到任何未標記的神經纖維，還可以優(yōu)化激光束的掃描時間。隨機訪問掃描可以通過聲光偏轉器（AOD）來實現(xiàn)，其原理是將具有一個射頻信號的壓電傳感器粘在合適的晶體上，所產生的聲波引起周期性的折射率光柵，激光束通過光柵時發(fā)生衍射。通過射頻電信號調控聲波的強度和頻率從而可以改變衍射光的強度和方向，這樣使用1個AOD就可以實現(xiàn)一維橫向的任意點掃描，利用1對AOD，結合其他軸向掃描技術可實現(xiàn)3D的隨機訪問掃描。但是該技術對樣本的運動很敏感，易出現(xiàn)運動偽影。目前，快速光柵掃描即在FOV中進行逐行掃描，由于利用算法可以輕松解決運動偽影而被普遍的使用。美國全自動多光子顯微鏡焦點激發(fā)多光子顯微鏡市場集中，由于投產生產的成本較高，技術難度大，目前涌現(xiàn)的新企業(yè)不多。

使用基因編碼的熒光探針可以在突觸和細胞分辨率下監(jiān)測體內神經元信號，這是揭示動物神經活動復雜機制的關鍵。使用雙光子顯微鏡（2PM）可以以亞細胞分辨率對鈣離子傳感器和谷氨酸傳感器成像，從而測量不透明大腦深處的活動；成像膜電壓變化能直接反映神經元活動，但神經元活動的速度對于常規(guī)的2PM來說太快。目前電壓成像主要通過寬場顯微鏡實現(xiàn)，但它的空間分辨率較差并且于淺層深度。因此要在不透明的大腦中以高空間分辨率對膜電壓變化進行成像，需要明顯提高2PM的成像速率。

世界多光子激光掃描顯微鏡產業(yè)主要布局在德國和日本，德國是以徠卡顯微系統(tǒng)和蔡司為，而日本以尼康和奧林巴斯公司為，2020年，上述企業(yè)占據(jù)著世界多光子激光掃描顯微鏡市場 64.44%的市場份額，其發(fā)展戰(zhàn)略左右著多光子激光掃描顯微鏡市場的走向。目前世界市場對多光子激光掃描顯微鏡的需求在增長，中國市場這方面的需求增長更快，未來五年多光子激光掃描顯微鏡市場的發(fā)展在中國將具有很大的發(fā)展?jié)摿?。國內顯微鏡制造市場目前斷層嚴重。目前我國顯微鏡行業(yè)發(fā)展缺乏技術沉淀，20 年以上經營積累的企業(yè)十分稀缺，深度精密制造、光學重要部件設計及工藝嚴重制約產業(yè)升級。目前中國顯微鏡中如多光子顯微鏡、共聚焦掃描和電子顯微鏡等主要集中在徠卡顯微系統(tǒng)、蔡司、尼康、奧林巴斯等國外企業(yè)。國內具備生產顯微鏡能力的企業(yè)屈指可數(shù)，若國內顯微鏡企業(yè)能打破技術壁壘，切入顯微鏡市場，企業(yè)的生產經營將騰躍至一個更高的格局。點掃描多光子顯微鏡可以深入樣本并捕捉高質量的圖像，但這個過程極其緩慢，因為圖像是一次形成一個點。

比較兩表格中的相關參數(shù)可以看出，基于分子光學標記的成像技術已經在生物活檢和基因表達規(guī)律方面展示了較大的優(yōu)勢。例如，正電子發(fā)射斷層成像（PET）可實現(xiàn)對分子代謝的成像，空間分辨率∶1-2mm，時間分辨率;分鐘量級。與PET比較，光學成像的應用場合更廣（可測量更多的參數(shù)，請參見表1-1），且具有更高的時間分辨率（秒級），空間分辨率可達到微米。因此，二者相比，雖然光學成像在測量深度方面不及PET，但在測量參數(shù)種類與時空分辨率方面有一定優(yōu)勢。對于小動物（如小白鼠）研究來說，光學成像技術可以實現(xiàn)小動物整體成像和在體基因表達成像。例如，初步研究表明，熒光介導層析成像可達到近10cm的測量深度;基于多光子激發(fā)的顯微成像技術可望實現(xiàn)小鼠體內基因表達的實時在體成像。多光子共聚焦掃描顯微鏡比雙光子共聚焦掃描顯微鏡具有更高的空間分辨率。清醒動物多光子顯微鏡供應商

顯微鏡簡史：從光到多光子顯微鏡。在體多光子顯微鏡實驗

儀器儀表行業(yè)飛速發(fā)展一是因為我國的經濟高速穩(wěn)定發(fā)展的運行;按照過去的經驗，如果GDP的增長在10%以上時，儀表行業(yè)的增長率則在26%～30%之間。二是因為我國宏觀調控對儀表行業(yè)的影響有一個滯后期，儀表往往在工程的后期才交付使用，因此，因宏觀調控政策而減少的收入對儀表行業(yè)的影響不會太大。進一步提升我國儀器儀表技術和水平，有限責任公司（自然）企業(yè)要順應產業(yè)發(fā)展潮流，在穩(wěn)固常規(guī)品種的同時，進一步發(fā)展智能儀器儀表，提升產業(yè)數(shù)字化、智能化、集成化水平。nVista，nVoke，3D bioplotte，invivo產業(yè)是國民經濟的基礎性、戰(zhàn)略性產業(yè)，是信息化和工業(yè)化深度融合的源頭，對促進工業(yè)轉型升級、發(fā)展戰(zhàn)略性新興產業(yè)、推動現(xiàn)代**建設、保證和提高大家生活水平具有重要作用。我們必須承認，在科學儀器上，我們跟其他地區(qū)相比，還有很大的差距。這個差距，就是我們提升的空間。合相關部門、大學和企業(yè)之力，中國的服務型必將在不遠的將來，在相關領域的基礎研究和重點光學部件研發(fā)上取得突破，產品進入世界中**水平，企業(yè)得到臺階式上升，迎頭趕上，與全球出名企業(yè)并駕齊驅。在體多光子顯微鏡實驗