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原代細(xì)胞的小知識：凍存通常我們不推薦重新凍存原代細(xì)胞，因為這可以促進(jìn)細(xì)胞衰老和/或?qū)е鹿δ茏兓?。原代?xì)胞非常敏感，重新凍結(jié)可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡或損傷。與細(xì)胞系不同，原代細(xì)胞增殖有限，我們建議盡早使用原代細(xì)胞進(jìn)行實驗以防止遺傳漂移，如果你正在使用一個增殖困難的細(xì)胞類型，你應(yīng)該密切監(jiān)測細(xì)胞形態(tài)，因為少量混雜的細(xì)胞（如成纖維細(xì)胞）可能隨著時間的推移，大量生長從而成為主要細(xì)胞。正常的原代細(xì)胞培養(yǎng)，在無污染的情況下，建議培養(yǎng)基中不加抗體，抗體會影響細(xì)胞的某些基因變異從而導(dǎo)致實驗數(shù)據(jù)有差異，所以cell systems的細(xì)胞在分離提取時就考慮到這點(diǎn)，他們不會采用任何抗體去分離和純化的同時，通過酶消化或者離心洗滌的方法讓細(xì)胞達(dá)到95%以上的純度，這樣得到的實驗數(shù)據(jù)更為準(zhǔn)確。原代細(xì)胞在生物醫(yī)藥領(lǐng)域有不可替代性作用，市場前景廣闊。鄭州正規(guī)原代細(xì)胞分離試劑盒單價

懸浮型原代細(xì)胞：1）必須保持細(xì)胞的懸浮狀態(tài)。可以通過增加培養(yǎng)液的黏度來幫助細(xì)胞呈懸浮狀態(tài)，如給培養(yǎng)液中加入低濃度的透明質(zhì)酸復(fù)合物。在有攪拌裝置的培養(yǎng)器皿內(nèi)加入培養(yǎng)液是，以5ml為較低限度，否則攪拌時會產(chǎn)生氣泡對細(xì)胞造成傷害。使用這種方式需注意勿使攪拌速度過快，否則即可使培養(yǎng)液溢出又容易造成污染。如果培養(yǎng)液的量在5ml以下，可以采用旋轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)。給懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞換液時要注意不要吸出細(xì)胞2）能夠進(jìn)行懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞，其生命力一般都比較旺盛，體外分裂增殖的速度較快，營養(yǎng)成分消耗大，換液時間隔一般較短。鄭州正規(guī)原代細(xì)胞分離試劑盒單價貼壁細(xì)胞多來自部位組織，而懸浮細(xì)胞多來自血液系統(tǒng)的細(xì)胞。

選擇原代細(xì)胞的原因：長期以來，科學(xué)家多依賴永生化的細(xì)胞系來進(jìn)行各種研究，但在過去十年，隨著細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展，細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域發(fā)生了巨大變化，新型的技術(shù)和培養(yǎng)試劑讓使用原代細(xì)胞作為研究對象成為可能。相比于細(xì)胞系，原代細(xì)胞更多保留了體內(nèi)原始組織的生物學(xué)特征，如生長和衰老，因此通過原代細(xì)胞可建立更好的細(xì)胞疾病模型。原代細(xì)胞（Primary cells）是指來源組織，經(jīng)過特定分離方法制備而成的初始細(xì)胞。 原代細(xì)胞離體時間短且不經(jīng)過永生化過程，其生物學(xué)特性未發(fā)生很大變化，仍保持原有的遺傳特征，可更好地反映細(xì)胞在體內(nèi)的生長狀態(tài)，從而獲得與體內(nèi)生理功能更接近的數(shù)據(jù)，很適合用于藥物測試、細(xì)胞分化和轉(zhuǎn)化等實驗研究。

原代細(xì)胞傳代培養(yǎng)方法：1.當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80-90%融合時需要傳代培養(yǎng)。2.提前準(zhǔn)備好多聚賴氨酸（PLL，貨號0403）或纖維粘連蛋白（BPF，貨號8248）包被好的培養(yǎng)瓶。3. 將完全培養(yǎng)基，胰酶/EDTA消化液（T/E，貨號0103），胰胰中和液（TNS，貨號0113）和不含鈣鎂離子的DPBS（貨號0303）加熱至室溫。我們不推薦用37度水浴加熱試劑和培養(yǎng)基。4.用DPBS沖洗細(xì)胞。5.以T-75培養(yǎng)瓶為例，向培養(yǎng)瓶中加入8mlDPBS，然后加入2ml胰酶/EDTA消化液。輕輕搖動培養(yǎng)瓶保證細(xì)胞被胰酶/EDTA消化液完全覆蓋。將培養(yǎng)瓶置于37度培養(yǎng)箱1-2分鐘直到細(xì)胞變圓。在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。6.在消化期間，準(zhǔn)備一支50ml離心管加入5ml胎牛血清（FBS，貨號0500）。取樣后培養(yǎng)時間較少需要一周以上的時間，期間可換液或者傳代。

原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染操作步驟（以24孔培養(yǎng)板為例）：A. 細(xì)胞接種：轉(zhuǎn)染前現(xiàn)在接種細(xì)胞，每孔500 μl培養(yǎng)基（不可加物品），使細(xì)胞在轉(zhuǎn)染時密度在30-50%。B. siRNA-RFectPM混合物準(zhǔn)備：1.6pmol siRNA 用50μl無血清培養(yǎng)基稀釋。2.2μl RFectPM用50μl無血清培養(yǎng)基稀釋。輕輕混勻，室溫孵育5min。注意：確保在25 min內(nèi)執(zhí)行第三步操作，不要過于延遲。3.孵育5min后，將siRNA 稀釋液與RFectPM稀釋液混合（總體積100μl）。輕輕混勻，室溫孵育20 min。C. 將混合物加到培養(yǎng)的細(xì)胞內(nèi)（完全培養(yǎng)基培養(yǎng)）：1.將100μl混合物加入培養(yǎng)孔內(nèi)，培養(yǎng)孔內(nèi)含有0.5ml培養(yǎng)的細(xì)胞。輕輕晃動培養(yǎng)板，混勻。2.37°C培養(yǎng)18-72h，檢測基因克制效果。如果需要，細(xì)胞培養(yǎng)4-6h時可以更換培養(yǎng)基，但不是必須。孵育時間的長短，取決于細(xì)胞類型、所干擾基因本身及分析方法。可設(shè)置不同的孵育時間進(jìn)行實驗以確定較佳孵育時間。轉(zhuǎn)染實驗優(yōu)化: 為了提高轉(zhuǎn)染效率，較好對轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行優(yōu)化，特別是開始使用。將凍存管立即從水浴中拿出，擦干，轉(zhuǎn)入無菌環(huán)境。鄭州正規(guī)原代細(xì)胞分離試劑盒單價

打開蓋子，注意手指不要碰到里面的螺紋。鄭州正規(guī)原代細(xì)胞分離試劑盒單價

關(guān)于細(xì)胞株和細(xì)胞系以及原代細(xì)胞的區(qū)別：1、獲取方法不同，原代細(xì)胞是指從機(jī)體取出后立即培養(yǎng)的細(xì)胞；細(xì)胞株是通過選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中獲得具有特殊性質(zhì)或標(biāo)志物的培養(yǎng)物；細(xì)胞系是原代細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)開始傳代成功后所繁殖的細(xì)胞群體。2、原代培養(yǎng)的細(xì)胞一般傳至10代左右就不容易傳下去了，細(xì)胞的生長就會出現(xiàn)停滯，大部分細(xì)胞衰老死亡。但是有極少數(shù)的細(xì)胞能夠度過“危機(jī)”而繼續(xù)傳下去，這些存活的細(xì)胞一般能夠傳到40--50代，這種傳代細(xì)胞叫做細(xì)胞株；細(xì)胞株的遺傳物質(zhì)沒有發(fā)生改變。當(dāng)細(xì)胞傳至50代以后又會出現(xiàn)“危機(jī)”，不能再傳下去。但是有部分細(xì)胞的遺傳物質(zhì)發(fā)生了改變，并且?guī)в凶兊奶攸c(diǎn)，有可能在培養(yǎng)條件下無限制地傳代下去，這種傳代細(xì)胞稱為細(xì)胞系。鄭州正規(guī)原代細(xì)胞分離試劑盒單價