開封正規(guī)細胞高效轉(zhuǎn)染試劑哪家便宜

來源: 發(fā)布時間:2022-05-16

細胞轉(zhuǎn)染實驗簡介:實驗原理外源基因進入細胞主要有四種方法:電擊法、磷酸鈣法和脂質(zhì)體介導(dǎo)法和細菌介導(dǎo)法。電擊法是在細胞上短時間暫時性的穿孔讓外源質(zhì)粒進入;磷酸鈣法和脂質(zhì)體法是利用不同的載體物質(zhì)攜帶質(zhì)粒通過直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因進入細胞;細菌法是利用包裝了外源基因的細菌傳染細胞的方法使得其進入細胞。但是由于電擊法和磷酸鈣法的實驗條件控制較嚴、難度較大;細菌法的前期準備較復(fù)雜、而且可能對于細胞有較大影響;所以現(xiàn)在對于很多普通細胞系,一般的瞬時轉(zhuǎn)染方法多采用脂質(zhì)體法。震蕩后將試劑放在-20攝氏度保存,使用前還需震蕩。開封正規(guī)細胞高效轉(zhuǎn)染試劑哪家便宜

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細胞轉(zhuǎn)染那些事兒:1.選擇傳代次數(shù)較低并處于對數(shù)生長期的細胞進行轉(zhuǎn)染。對大多數(shù)細胞而言,均需要在轉(zhuǎn)染當天或前現(xiàn)在鋪板,第二天上午進行轉(zhuǎn)染,48h后收集細胞進行功能檢測。對于原代細胞,可用促有絲分裂刺激物進行細胞活化。2.對于貼壁細胞,一般要求在轉(zhuǎn)染前一日,用胰酶處理為單細胞懸液,重新接種于培養(yǎng)皿或瓶,較好在轉(zhuǎn)染前4小時換一次新鮮培養(yǎng)液。3.支原體污染會嚴重降低細胞轉(zhuǎn)染的效率,且支原體不會像細菌污染那么明顯,因而轉(zhuǎn)染前可用環(huán)丙沙星處理細胞以除去支原體。4.細胞轉(zhuǎn)染時需要一定的細胞密度,以70-90%(貼壁細胞)或2×106-4×106細胞/ml(懸浮細胞)為宜。廈門細胞高效轉(zhuǎn)染試劑單價一類是瞬時轉(zhuǎn)染,一類是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染(很長轉(zhuǎn)染)。

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細胞轉(zhuǎn)染那些事兒:1.設(shè)置陰性和陽性對照:一般在轉(zhuǎn)染后24-48h,靶基因即在細胞內(nèi)表達??梢罁?jù)不同的實驗?zāi)康模?4-48h后即可進行靶基因表達的檢測等實驗。2.轉(zhuǎn)染后效率的檢測方法:觀察轉(zhuǎn)染后細胞熒光情況;qPCR驗證;WB檢測敲減或過表達蛋白。3.轉(zhuǎn)染效率低,可采取以下兩種方法:1)復(fù)轉(zhuǎn)染,即轉(zhuǎn)染后12-24h再進行轉(zhuǎn)染,前提是該細胞對脂質(zhì)體的耐受性較好,轉(zhuǎn)染后細胞死亡數(shù)較少。2)通過藥篩來殺死未轉(zhuǎn)入成功的細胞,前提是該質(zhì)粒帶有物品抗性的基因。4.電轉(zhuǎn)時,不同的細胞需要的電壓是不一樣的,需要做預(yù)實驗,摸索較佳條件。對于大多數(shù)細胞而言,較佳電壓位于250-1250v/cm。電擊后,應(yīng)該將DNA和細胞混合液在室溫下放置10min,使細胞恢復(fù)損傷。

瞬時轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染效率的監(jiān)測:基因的瞬時表達在24-72小時內(nèi)就結(jié)束了。這種快速的瞬時表達非常適用于驗證質(zhì)粒表達和監(jiān)測轉(zhuǎn)染步驟的效率。可以使用報告基因來確定優(yōu)化條件,其表達蛋白易檢測,在目的細胞中不含此蛋白或水平很低。常用的報告基因包括氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT),綠色熒光蛋白(GFP),熒光素酶(Lux或Luc)以及b-半乳糖苷酶(b-gal)。可以使用簡單的非同位素方法檢測b-gal的表達以測定轉(zhuǎn)染效率和活性。pCMVSPORT-bgal質(zhì)粒包含CMV啟動子調(diào)控下的LacZ基因,轉(zhuǎn)染入真核細胞內(nèi)后可以直接表達bgal。結(jié)合簡單的檢測步驟,可以做為監(jiān)測轉(zhuǎn)染條件的一種方便靈敏的方法。細胞轉(zhuǎn)染是完成這一過程的必需步驟。

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轉(zhuǎn)染的注意事項:培養(yǎng)基中的物品物品,比如青霉素和鏈霉素,是影響轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基添加物。這些物品一般對于真核細胞無毒,但陽離子脂質(zhì)體試劑增加了細胞的通透性,使物品可以進入細胞。這降低了細胞的活性,導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低。所以,在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中不能使用物品,甚至在準備轉(zhuǎn)染前進行細胞鋪板時也要避免使用物品。這樣,在轉(zhuǎn)染前也不必潤洗細胞。對于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,不要在選擇性培養(yǎng)基中使用青霉素和鏈霉素,因為這些物品是GENETICIN選擇性物品的競爭性克制劑。另外,為了保證無血清培養(yǎng)基中細胞的健康生長,使用比含血清培養(yǎng)基更少的物品量。大多數(shù)已建立的細胞系都是非整倍體,原代培養(yǎng)包括了表達不同基因組合的細胞的混合物。細胞培養(yǎng)在實驗室中保存數(shù)月和數(shù)年后會經(jīng)歷突變,總?cè)旧w重組或基因調(diào)控變化等而演化,這會導(dǎo)致和轉(zhuǎn)染相關(guān)的細胞行為的變化。如果隨時間發(fā)現(xiàn)這種變化,融化一管新鮮的細胞可能會恢復(fù)原先的轉(zhuǎn)染活性。比如,新鮮融化的NIH3T3細胞比傳代8次的細胞表現(xiàn)出更高的轉(zhuǎn)染效率,融化細胞的進一步傳代并沒有降低轉(zhuǎn)染效率。因此,如果觀察到轉(zhuǎn)染效率降低,可以試著轉(zhuǎn)染新鮮培養(yǎng)的細胞以恢復(fù)較佳結(jié)果。對于貼壁細胞,一般要求在轉(zhuǎn)染前一日,用胰酶處理為單細胞懸液。青島細胞高效轉(zhuǎn)染試劑報價

其它物理和化學(xué)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法,則各有其特點。開封正規(guī)細胞高效轉(zhuǎn)染試劑哪家便宜

細胞轉(zhuǎn)染的原理、操作步驟以及小技巧:脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染操作步驟:(1)細胞培養(yǎng):取6cm細胞皿,向每孔中加入2mL含1~2×105個細胞培養(yǎng)液,37℃CO2培養(yǎng)密度至40%~60%,密度過大,轉(zhuǎn)染后不利篩選細胞。(2)轉(zhuǎn)染液制備:在EP管中制備以下兩液(為轉(zhuǎn)染每一個孔細胞所用的量)A液:用不含血清培養(yǎng)基稀釋1ug質(zhì)粒DNA。B液:用不含血清培養(yǎng)基稀釋2ul脂質(zhì)體。分別將A液與B液輕彈混勻,靜置5分鐘。(3)吸取B液加入至A液中,輕彈混勻。室溫中置10-15分鐘。(4)轉(zhuǎn)染準備:用1mL不含血清培養(yǎng)液漂洗兩次,再加入4mL不含血清培養(yǎng)液。(5)轉(zhuǎn)染:把A/B復(fù)合物緩緩加入培養(yǎng)液中,搖勻,37℃溫箱置6~24小時,吸除無血清轉(zhuǎn)染液,換入正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。(6)瞬時轉(zhuǎn)染后,可在48h-72h細胞長滿之后,提取細胞蛋白或者RNA,驗證敲減/過表達效率。開封正規(guī)細胞高效轉(zhuǎn)染試劑哪家便宜