聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的特點(diǎn)：特異性強(qiáng)，PCR反應(yīng)的特異性決定因素為：引物與模板DNA特異正確的結(jié)合；堿基配對(duì)原則；Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性；靶基因的特異性與保守性。其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵。引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對(duì)原則的。聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性及TaqDNA聚合酶耐高溫性，使反應(yīng)中模板與引物的結(jié)合（復(fù)性）可以在較高的溫度下進(jìn)行，結(jié)合的特異性增加，被擴(kuò)增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過(guò)選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是80年代中期發(fā)展起來(lái)的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。黃山實(shí)時(shí)定量PCR聚合酶鏈反應(yīng)：流聚合酶鏈反應(yīng):一種偽等溫PCR...

聚合酶鏈反應(yīng)的常見(jiàn)問(wèn)題分析與解決方法：無(wú)擴(kuò)增條帶：酶失活或在反應(yīng)體系中未加入酶。Taq DNA聚合酶因保存或運(yùn)輸不當(dāng)而失活，往往通過(guò)更換新酶或用另一來(lái)源的酶以獲得滿意的結(jié)果。模板含有雜質(zhì)。特別是對(duì)甲醛固定及石蠟包埋的組織常含甲酸，造成DNA脫嘌呤而影響PCR的結(jié)果。變性溫度是否準(zhǔn)確：PCR儀指示溫度與實(shí)際溫度是否相符，過(guò)高酶在前幾個(gè)循環(huán)就迅速失活；過(guò)低則模板變性不徹底。反應(yīng)系統(tǒng)中污染了蛋白酶及核酸酶，應(yīng)在未加Taq酶以前，將反應(yīng)體系95℃加熱5-10 min。引物變質(zhì)失效。人工合成的引物是否正確。是否純化，或因儲(chǔ)存條件不當(dāng)而失活。引物錯(cuò)誤。利用BLAST檢查引物特異性或重新設(shè)計(jì)引物。 DNA凝...

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的試驗(yàn)污染：實(shí)驗(yàn)室中克隆質(zhì)粒的污染：在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室及某些用克隆質(zhì)粒做陽(yáng)性對(duì)照的檢驗(yàn)室，這個(gè)問(wèn)題也比較常見(jiàn)。因?yàn)榭寺≠|(zhì)粒在單位容積內(nèi)含量相當(dāng)高，另外在純化過(guò)程中需用較多的用具及試劑，而且在活細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒，由于活細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖的簡(jiǎn)便性及具有很強(qiáng)的生命力。其污染可能性也很大。污染的監(jiān)測(cè)：一個(gè)好的實(shí)驗(yàn)室，要時(shí)刻注意污染的監(jiān)測(cè)，考慮有無(wú)污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。重復(fù)性試驗(yàn)。選擇不同區(qū)域的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)準(zhǔn)備：引物內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)互補(bǔ)序列。上海組織定量PCR服務(wù)聚合酶鏈反應(yīng)：等位基因特異性聚合酶鏈反應(yīng):基于單核苷酸變異的診斷或克隆技術(shù)(snv不...

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)準(zhǔn)備：PCR所用的酶主要有兩種來(lái)源：Taq和Pfu，分別來(lái)自兩種不同的噬熱菌。其中Taq擴(kuò)增效率高但易發(fā)生錯(cuò)配。Pfu擴(kuò)增效率弱但有糾錯(cuò)功能。所以實(shí)際使用時(shí)根據(jù)需要必須做不同的選擇。模板即擴(kuò)增用的DNA，可以是任何來(lái)源，但有兩個(gè)原則，純度必須較高，第二濃度不能太高以免抑制。緩沖液的成分很為復(fù)雜，除水外一般包括四個(gè)有效成分：緩沖體系，一般使用HEPES或MOPS緩沖體系；一價(jià)陽(yáng)離子，一般采用鉀離子，但在特殊情況下也可使用銨根離子；二價(jià)陽(yáng)離子，即鎂離子，根據(jù)反應(yīng)體系確定，除特殊情況外不需調(diào)整；輔助成分，常見(jiàn)的有DMSO、甘油等，主要用來(lái)保持酶的活性和幫助DNA解除纏繞結(jié)構(gòu)。聚合酶鏈反...

聚合酶鏈反應(yīng)：嵌套聚合酶鏈反應(yīng):通過(guò)減少DNA非特異性擴(kuò)增的背景，提高DNA擴(kuò)增的特異性。兩組引物用于兩個(gè)連續(xù)的PCR。在個(gè)反應(yīng)中，一對(duì)引物用于產(chǎn)生DNA產(chǎn)物，除了預(yù)期的靶之外，該產(chǎn)物可能仍然由非特異性擴(kuò)增的DN段組成。然后用一組引物將產(chǎn)物用于第二次聚合酶鏈反應(yīng)，所述引物的結(jié)合位點(diǎn)完全或部分不同于次反應(yīng)中使用的每個(gè)引物，并且位于其中的3’。嵌套式PCR在特異性擴(kuò)增長(zhǎng)DN段方面通常比傳統(tǒng)PCR更成功，但它需要更詳細(xì)的目標(biāo)序列知識(shí)。重疊延伸聚合酶鏈反應(yīng)或者通過(guò)重疊延伸拼接(SOEing):一種用于將兩個(gè)或多個(gè)含有互補(bǔ)序列的DN段拼接在一起的基因工程技術(shù)。它用于連接含有基因、調(diào)節(jié)序列或突變的DN段；...

PCR的反應(yīng)條件：dNTP濃度過(guò)高會(huì)加快反應(yīng)速度，但同時(shí)還可以增加堿基的錯(cuò)誤摻入率。引物濃度過(guò)高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增。TaqDNA聚合酶濃度過(guò)高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增，低則合成產(chǎn)物量減少。TaqDNA聚合酶無(wú)校正功能，摻入錯(cuò)誤率達(dá)2*E-4個(gè)核苷酸，一個(gè)30個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)0.1%-0.25%總錯(cuò)誤率。在90～95度下可使整個(gè)基因組的DNA變性為單鏈。一般94～95度30～60s。時(shí)間過(guò)長(zhǎng)使TaqDNA聚合酶失活和dNTP破壞增多。DNA很快冷卻到40～60度使引物和模板結(jié)合。引物長(zhǎng)度在15～25時(shí)退火溫度。逆轉(zhuǎn)錄酶將核糖核酸逆轉(zhuǎn)錄成cDNA ，然后通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增。深圳...

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)準(zhǔn)備：PCR所用的酶主要有兩種來(lái)源：Taq和Pfu，分別來(lái)自兩種不同的噬熱菌。其中Taq擴(kuò)增效率高但易發(fā)生錯(cuò)配。Pfu擴(kuò)增效率弱但有糾錯(cuò)功能。所以實(shí)際使用時(shí)根據(jù)需要必須做不同的選擇。模板即擴(kuò)增用的DNA，可以是任何來(lái)源，但有兩個(gè)原則，純度必須較高，第二濃度不能太高以免抑制。緩沖液的成分很為復(fù)雜，除水外一般包括四個(gè)有效成分：緩沖體系，一般使用HEPES或MOPS緩沖體系；一價(jià)陽(yáng)離子，一般采用鉀離子，但在特殊情況下也可使用銨根離子；二價(jià)陽(yáng)離子，即鎂離子，根據(jù)反應(yīng)體系確定，除特殊情況外不需調(diào)整；輔助成分，常見(jiàn)的有DMSO、甘油等，主要用來(lái)保持酶的活性和幫助DNA解除纏繞結(jié)構(gòu)。如果基因的...

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：因?yàn)镻CR擴(kuò)增了目的DNA區(qū)域，所以PCR可以用于分析極少量的樣品。這對(duì)于法醫(yī)檢定法，當(dāng)時(shí)只有微量的DNA可作為證據(jù)。聚合酶鏈反應(yīng)也可用于分析古代DNA那已經(jīng)有數(shù)萬(wàn)年的歷史了。這些基于聚合酶鏈反應(yīng)的技術(shù)已經(jīng)成功地應(yīng)用于動(dòng)物身上，例如四萬(wàn)年前猛犸，以及人類DNA，應(yīng)用范圍從分析埃及木乃伊識(shí)別一個(gè)俄羅斯沙皇和英國(guó)國(guó)王理查三世遺體的鑒定。定量聚合酶鏈反應(yīng)或者實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)不要與逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)方法混淆)允許估計(jì)樣品中存在的給定序列的量——這種技術(shù)通常用于定量確定基因表達(dá)的水平。定量PCR是一種已建立的DNA定量工具，用于測(cè)量每輪PCR擴(kuò)增后DNA產(chǎn)物的積累。聚合酶鏈反應(yīng)非常敏感...

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的常見(jiàn)問(wèn)題：PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)時(shí)間一般為48h以內(nèi)，有些很好于當(dāng)日電泳檢測(cè)，大于48h后帶型不規(guī)則甚至消失。假陰性：不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶。PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有模板核酸的制備，引物的質(zhì)量與特異性，酶的質(zhì)量及溴乙錠的使用， PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。模板：模板中含有雜蛋白質(zhì)，模板中含有Taq酶抑制劑，模板中蛋白質(zhì)沒(méi)有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，在提取制備模板時(shí)丟失過(guò)多，或吸入酚。模板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處理，模板核酸提取過(guò)程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng) 固定不宜隨意更改?，F(xiàn)在有...

聚合酶鏈反應(yīng)的常見(jiàn)問(wèn)題分析與解決方法：PCR產(chǎn)物量過(guò)少：退火溫度不合適。以2度為梯度設(shè)計(jì)梯度PCR反應(yīng)優(yōu)化退火溫度。DNA模板量太少。增加DNA模板量。PCR循環(huán)數(shù)不足。增加反應(yīng)循環(huán)數(shù)。引物量不足。增加體系中引物含量。延伸時(shí)間太短。以1 kb/min的原則設(shè)置延伸時(shí)間。變性時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。變性時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致DNA聚合酶失活。DNA模板中存在抑制劑。確保DNA模板干凈。擴(kuò)增產(chǎn)物在凝膠中涂布或成片狀條帶彌散：酶量過(guò)高。減少酶量；酶的質(zhì)量差，調(diào)換另一來(lái)源的酶。dNTP濃度過(guò)高。減少dNTP的濃度。PCR反應(yīng)的特異性決定因素為：引物與模板DNA特異正確的結(jié)合。珠海組織定量PCR應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)：流聚合酶鏈反...

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的試驗(yàn)污染：PCR反應(yīng)的很大特點(diǎn)是具有較大擴(kuò)增能力與極高的靈敏性，但令人腦袋不適的問(wèn)題是易污染，極其微量的污染即可造成假陽(yáng)性的產(chǎn)生。 污染原因：標(biāo)本間交叉污染：標(biāo)本污染主要有收集標(biāo)本的容器被污染，或標(biāo)本放置時(shí)，由于密封不嚴(yán)溢于容器外，或容器外粘有標(biāo)本而造成相互間交叉污染；標(biāo)本核酸模板在提取過(guò)程中，由于吸樣污染導(dǎo)致標(biāo)本間污染；有些微生物標(biāo)本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴(kuò)散，導(dǎo)致彼此間的污染。PCR試劑的污染：主要是由于在PCR試劑配制過(guò)程中，由于加樣、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。嵌套聚合酶鏈反應(yīng)的兩組引物用于兩個(gè)連續(xù)的PCR。南京分子生物學(xué)PCR檢測(cè)技術(shù)原理聚...

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：三步：變性：模板DNA加熱變性；復(fù)性，引物與它的靶序列發(fā)生退火，引物DNA量多，使引物和模板在局部形成雜交鏈；延伸，4種dNTP 與 Mg2+ 存在的條件下，DNA合成酶催化以引物為起始點(diǎn)，按5'-3'方向進(jìn)行延伸。上面三步為一個(gè)循環(huán)，可使拷貝數(shù)到達(dá)2*E－6-2*E－7。PCR產(chǎn)物一段雙鏈DNA，是由它的末端引物的5’端決定的。首輪擴(kuò)增，其產(chǎn)物是大小不均一的DNA分子。長(zhǎng)度應(yīng)大于兩引物之間的長(zhǎng)度。在第二個(gè)循環(huán)中，由于5'固定，其產(chǎn)物長(zhǎng)度就由等于兩引物之間的長(zhǎng)度。所以幾十個(gè)循環(huán)后就會(huì)產(chǎn)生大量的兩引物之間序列。多重連接依賴探針擴(kuò)增允許用單個(gè)引物對(duì)擴(kuò)增多個(gè)靶標(biāo)，從而避免多重PCR的...

聚合酶鏈反應(yīng)的常見(jiàn)問(wèn)題分析與解決方法：反應(yīng)緩沖液未完全融化或未充分混勻。確保反應(yīng)緩沖液融化完全并徹底混勻。引物特異性差。利用BLAST檢查引物特異性或重新設(shè)計(jì)引物。引物量過(guò)多。減少反應(yīng)體系中引物的用量。模板量過(guò)多。質(zhì)粒DNA的用量應(yīng)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的循環(huán)參數(shù)：預(yù)變性，模板DNA完全變性與PCR酶的完全對(duì)PCR能否成功至關(guān)重要，建議加熱時(shí)間參考試劑說(shuō)明書，一般未修飾的Taq酶時(shí)間為兩分鐘。變性步驟，循環(huán)中一般95℃，30秒足以使各種靶DNA序列完全變性，可能的情況下可縮短該步驟時(shí)間。變性時(shí)間過(guò)長(zhǎng)損害酶活性，過(guò)短靶序列變性不徹底，易造成擴(kuò)增失敗。引物退火，退火溫度需要從多方面去決定，一般根據(jù)引物的Tm值為參考，根據(jù)擴(kuò)增的長(zhǎng)度適當(dāng)下調(diào)作為退火溫度。然后在此次實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上做出預(yù)估。退火溫度對(duì)PCR的特異性有較大影響。引物延伸，引物延伸一般在72℃進(jìn)行（Taq酶很適溫度）。但在擴(kuò)增長(zhǎng)度較短且退火溫度較高時(shí)，本步驟可省略延伸時(shí)間隨擴(kuò)增片...

聚合酶鏈反應(yīng)：嵌套聚合酶鏈反應(yīng):通過(guò)減少DNA非特異性擴(kuò)增的背景，提高DNA擴(kuò)增的特異性。兩組引物用于兩個(gè)連續(xù)的PCR。在個(gè)反應(yīng)中，一對(duì)引物用于產(chǎn)生DNA產(chǎn)物，除了預(yù)期的靶之外，該產(chǎn)物可能仍然由非特異性擴(kuò)增的DN段組成。然后用一組引物將產(chǎn)物用于第二次聚合酶鏈反應(yīng)，所述引物的結(jié)合位點(diǎn)完全或部分不同于次反應(yīng)中使用的每個(gè)引物，并且位于其中的3’。嵌套式PCR在特異性擴(kuò)增長(zhǎng)DN段方面通常比傳統(tǒng)PCR更成功，但它需要更詳細(xì)的目標(biāo)序列知識(shí)。重疊延伸聚合酶鏈反應(yīng)或者通過(guò)重疊延伸拼接(SOEing):一種用于將兩個(gè)或多個(gè)含有互補(bǔ)序列的DN段拼接在一起的基因工程技術(shù)。它用于連接含有基因、調(diào)節(jié)序列或突變的DN段；...

序列標(biāo)簽站點(diǎn)是一個(gè)過(guò)程，其中PCR被用作基因組的特定片段存在于特定克隆中的指示物。人類基因組計(jì)劃發(fā)現(xiàn)這一應(yīng)用對(duì)于繪制他們測(cè)序的粘?？寺∫约皡f(xié)調(diào)不同實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果至關(guān)重要。聚合酶鏈反應(yīng)的一個(gè)令人興奮的應(yīng)用是對(duì)來(lái)自遠(yuǎn)古來(lái)源的DNA進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，例如在尼安德特人的復(fù)原骨骼中、從猛犸的冷凍組織中或從埃及木乃伊的大腦中發(fā)現(xiàn)的DNA已經(jīng)被放大和測(cè)序。]在某些情況下，這些來(lái)源的高度降解的DNA可能在擴(kuò)增的早期階段重新組裝。聚合酶鏈反應(yīng)的一個(gè)常見(jiàn)應(yīng)用是對(duì)以下基因表達(dá)模式的研究。組織(甚至單個(gè)細(xì)胞)可以在不同階段進(jìn)行分析，以了解哪些基因變得活躍，哪些基因被關(guān)閉。該應(yīng)用還可以使用定量聚合酶鏈反應(yīng)來(lái)定量表達(dá)的實(shí)際...

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：三步：變性：模板DNA加熱變性；復(fù)性，引物與它的靶序列發(fā)生退火，引物DNA量多，使引物和模板在局部形成雜交鏈；延伸，4種dNTP 與 Mg2+ 存在的條件下，DNA合成酶催化以引物為起始點(diǎn)，按5'-3'方向進(jìn)行延伸。上面三步為一個(gè)循環(huán)，可使拷貝數(shù)到達(dá)2*E－6-2*E－7。PCR產(chǎn)物一段雙鏈DNA，是由它的末端引物的5’端決定的。首輪擴(kuò)增，其產(chǎn)物是大小不均一的DNA分子。長(zhǎng)度應(yīng)大于兩引物之間的長(zhǎng)度。在第二個(gè)循環(huán)中，由于5'固定，其產(chǎn)物長(zhǎng)度就由等于兩引物之間的長(zhǎng)度。所以幾十個(gè)循環(huán)后就會(huì)產(chǎn)生大量的兩引物之間序列。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程。莆田血液...

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的常見(jiàn)問(wèn)題：靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其PCR擴(kuò)增是不會(huì)成功的。假陽(yáng)性：出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高。引物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。需重新設(shè)計(jì)引物。出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶：PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過(guò)多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過(guò)高，Mg2+濃度過(guò)高，退火溫度過(guò)低，循環(huán)次數(shù)過(guò)多引起。其對(duì)策有：減少酶量，或...

聚合酶鏈反應(yīng)的常見(jiàn)問(wèn)題分析與解決方法：反應(yīng)緩沖液未完全融化或未充分混勻。確保反應(yīng)緩沖液融化完全并徹底混勻。引物特異性差。利用BLAST檢查引物特異性或重新設(shè)計(jì)引物。引物量過(guò)多。減少反應(yīng)體系中引物的用量。模板量過(guò)多。質(zhì)粒DNA的用量應(yīng)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的試驗(yàn)污染：陽(yáng)性對(duì)照：在建立PCR反應(yīng)實(shí)驗(yàn)室及一般的檢驗(yàn)單位都應(yīng)設(shè)有PCR陽(yáng)性對(duì)照，它是PCR反應(yīng)是否成功、產(chǎn)物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個(gè)重要的參考標(biāo)志。陽(yáng)性對(duì)照要選擇擴(kuò)增度中等、重復(fù)性好，經(jīng)各種鑒定是該產(chǎn)物的標(biāo)本，如以重組質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，其含量宜低不宜高（100個(gè)拷貝以下）。但陽(yáng)性對(duì)照尤其是重組質(zhì)粒及高濃度陽(yáng)性標(biāo)本，其對(duì)檢測(cè)或擴(kuò)增樣品污染的可能性很大。因而當(dāng)某一PCR試劑經(jīng)自己使用穩(wěn)定，檢驗(yàn)人員心中有數(shù)時(shí)，在以后的實(shí)驗(yàn)中可免設(shè)陽(yáng)性對(duì)照。陰性對(duì)照：每次PCR實(shí)驗(yàn)務(wù)必做陰性對(duì)照。它包括：標(biāo)本對(duì)照：被檢的標(biāo)本是血清就用鑒定后的正常血清作對(duì)照；被檢的標(biāo)本是組織細(xì)胞就用相應(yīng)的組...

聚合酶鏈反應(yīng)的常見(jiàn)問(wèn)題分析與解決方法：無(wú)擴(kuò)增條帶：酶失活或在反應(yīng)體系中未加入酶。Taq DNA聚合酶因保存或運(yùn)輸不當(dāng)而失活，往往通過(guò)更換新酶或用另一來(lái)源的酶以獲得滿意的結(jié)果。模板含有雜質(zhì)。特別是對(duì)甲醛固定及石蠟包埋的組織常含甲酸，造成DNA脫嘌呤而影響PCR的結(jié)果。變性溫度是否準(zhǔn)確：PCR儀指示溫度與實(shí)際溫度是否相符，過(guò)高酶在前幾個(gè)循環(huán)就迅速失活；過(guò)低則模板變性不徹底。反應(yīng)系統(tǒng)中污染了蛋白酶及核酸酶，應(yīng)在未加Taq酶以前，將反應(yīng)體系95℃加熱5-10 min。引物變質(zhì)失效。人工合成的引物是否正確。是否純化，或因儲(chǔ)存條件不當(dāng)而失活。引物錯(cuò)誤。利用BLAST檢查引物特異性或重新設(shè)計(jì)引物。 DNA凝...

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)準(zhǔn)備：PCR引物設(shè)計(jì)：PCR反應(yīng)中有兩條引物，即5′端引物和3′引物。設(shè)計(jì)引物時(shí)以一條DNA單鏈為基準(zhǔn)（常以信息鏈為基準(zhǔn)），5′端引物與位于待擴(kuò)增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物與位于待擴(kuò)增片段3′端的一小段DNA序列互補(bǔ)。引物設(shè)計(jì)的基本原則：引物長(zhǎng)度：15-30bp，常用為20bp左右。引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C 過(guò)多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC很好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列參照。聚合酶鏈反應(yīng)可用于產(chǎn)生突變基因，突變由科學(xué)家隨意選擇。南通骨頭定量PCR原理現(xiàn)在有些PCR因?yàn)閿U(kuò)增區(qū)很短，即使Taq酶活...

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：因?yàn)镻CR擴(kuò)增了目的DNA區(qū)域，所以PCR可以用于分析極少量的樣品。這對(duì)于法醫(yī)檢定法，當(dāng)時(shí)只有微量的DNA可作為證據(jù)。聚合酶鏈反應(yīng)也可用于分析古代DNA那已經(jīng)有數(shù)萬(wàn)年的歷史了。這些基于聚合酶鏈反應(yīng)的技術(shù)已經(jīng)成功地應(yīng)用于動(dòng)物身上，例如四萬(wàn)年前猛犸，以及人類DNA，應(yīng)用范圍從分析埃及木乃伊識(shí)別一個(gè)俄羅斯沙皇和英國(guó)國(guó)王理查三世遺體的鑒定。定量聚合酶鏈反應(yīng)或者實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)不要與逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)方法混淆)允許估計(jì)樣品中存在的給定序列的量——這種技術(shù)通常用于定量確定基因表達(dá)的水平。定量PCR是一種已建立的DNA定量工具，用于測(cè)量每輪PCR擴(kuò)增后DNA產(chǎn)物的積累。聚合酶鏈反應(yīng)可用于產(chǎn)...

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：1976年，中國(guó)科學(xué)家，發(fā)現(xiàn)了穩(wěn)定的Taq DNA聚合酶，為PCR技術(shù)發(fā)展也做出了基礎(chǔ)性貢獻(xiàn)。PCR是利用DNA在體外攝氏95°高溫時(shí)變性會(huì)變成單鏈，低溫（經(jīng)常是60°C左右）時(shí)引物與單鏈按堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則結(jié)合，標(biāo)本核酸模板在提取過(guò)程中，由于吸樣污染導(dǎo)致標(biāo)本間污染；有些微生物標(biāo)本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴(kuò)散再調(diào)溫度至DNA聚合酶很適反應(yīng)溫度（72°C左右），DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補(bǔ)鏈?；诰酆厦钢圃斓腜CR儀實(shí)際就是一個(gè)溫控設(shè)備，能在變性溫度，復(fù)性溫度，延伸溫度之間很好地進(jìn)行控制。熱啟動(dòng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)可以通過(guò)將反應(yīng)組分加熱到變性溫度在...

絕大多數(shù)聚合酶鏈反應(yīng)方法依賴于熱循環(huán)。熱循環(huán)將反應(yīng)物暴露于加熱和冷卻的重復(fù)循環(huán)中，以允許不同的溫度依賴性反應(yīng)——具體地說(shuō)，脫氧核糖核酸融化和酶-驅(qū)動(dòng)DNA復(fù)制。聚合酶鏈反應(yīng)使用兩種主要試劑-引物(引物是短的單鏈DN段，稱為寡核苷酸，是目標(biāo)DNA區(qū)域的互補(bǔ)序列)和DNA聚合酶。在PCR反應(yīng)的步，DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的兩條鏈在高溫下物理分離，這個(gè)過(guò)程稱為脫氧核糖核酸變性。第二步，降低溫度，引物與互補(bǔ)的脫氧核糖核酸序列結(jié)合。這兩條DNA鏈就變成了模板，以酶促的方式從構(gòu)成DNA的自由核苷酸中組裝出一條新的DNA鏈。隨著聚合酶鏈反應(yīng)的進(jìn)行，產(chǎn)生的DNA本身被用作復(fù)制的模板，啟動(dòng)了一個(gè)連鎖反應(yīng)，原始的DNA模...

聚合酶鏈反應(yīng)的常見(jiàn)問(wèn)題分析與解決方法：反應(yīng)緩沖液未完全融化或未充分混勻。確保反應(yīng)緩沖液融化完全并徹底混勻。引物特異性差。利用BLAST檢查引物特異性或重新設(shè)計(jì)引物。引物量過(guò)多。減少反應(yīng)體系中引物的用量。模板量過(guò)多。質(zhì)粒DNA的用量應(yīng)

聚合酶鏈反應(yīng)同時(shí)擴(kuò)增單個(gè)精子中幾個(gè)基因座的能力]增強(qiáng)了極大地增強(qiáng)了通過(guò)研究減數(shù)分裂后染色體交叉來(lái)進(jìn)行基因定位的傳統(tǒng)任務(wù)。通過(guò)分析數(shù)千個(gè)單個(gè)精子，已經(jīng)直接觀察到非常緊密基因座之間罕見(jiàn)的交叉事件。類似地，可以分析異常的缺失、插入、易位或倒位，所有這些都無(wú)需等待(或支付)漫長(zhǎng)而艱苦的受精、胚胎發(fā)生等過(guò)程。定點(diǎn)突變：聚合酶鏈反應(yīng)可用于產(chǎn)生突變基因，突變由科學(xué)家隨意選擇?？梢赃x擇這些突變來(lái)理解蛋白質(zhì)是如何完成其功能的，并改變或改善蛋白質(zhì)功能。聚合酶鏈反應(yīng)可以選擇這些突變來(lái)理解蛋白質(zhì)是如何完成其功能的，并改變或改善蛋白質(zhì)功能。蘇州血液熒光PCR設(shè)計(jì)公司聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：三步：變性：模板DNA加熱變性；復(fù)性，...

絕大多數(shù)聚合酶鏈反應(yīng)方法依賴于熱循環(huán)。熱循環(huán)將反應(yīng)物暴露于加熱和冷卻的重復(fù)循環(huán)中，以允許不同的溫度依賴性反應(yīng)——具體地說(shuō)，脫氧核糖核酸融化和酶-驅(qū)動(dòng)DNA復(fù)制。聚合酶鏈反應(yīng)使用兩種主要試劑-引物(引物是短的單鏈DN段，稱為寡核苷酸，是目標(biāo)DNA區(qū)域的互補(bǔ)序列)和DNA聚合酶。在PCR反應(yīng)的步，DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的兩條鏈在高溫下物理分離，這個(gè)過(guò)程稱為脫氧核糖核酸變性。第二步，降低溫度，引物與互補(bǔ)的脫氧核糖核酸序列結(jié)合。這兩條DNA鏈就變成了模板，以酶促的方式從構(gòu)成DNA的自由核苷酸中組裝出一條新的DNA鏈。隨著聚合酶鏈反應(yīng)的進(jìn)行，產(chǎn)生的DNA本身被用作復(fù)制的模板，啟動(dòng)了一個(gè)連鎖反應(yīng)，原始的DNA模...

聚合酶鏈反應(yīng)：流聚合酶鏈反應(yīng):一種偽等溫PCR方法。將溶液置于熱梯度下，而不是反復(fù)加熱和冷卻聚合酶鏈反應(yīng)混合物。由此產(chǎn)生的熱不穩(wěn)定性驅(qū)動(dòng)對(duì)流流動(dòng)自動(dòng)將聚合酶鏈反應(yīng)試劑從熱區(qū)域和冷區(qū)域打亂，從而反復(fù)啟動(dòng)聚合酶鏈反應(yīng)。通過(guò)利用混沌流場(chǎng)的出現(xiàn)，可以優(yōu)化熱邊界條件和PCR外殼的幾何形狀等參數(shù)，以產(chǎn)生特異和快速的PCR。這種對(duì)流聚合酶鏈反應(yīng)設(shè)置明顯降低了設(shè)備功率需求和操作時(shí)間。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)):用于從RNA中擴(kuò)增DNA。逆轉(zhuǎn)錄酶將核糖核酸逆轉(zhuǎn)錄成cDNA ，然后通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)較廣用于表達(dá)譜，以確定基因的表達(dá)或鑒定RNA轉(zhuǎn)錄物的序列，包括轉(zhuǎn)錄起始和...

聚合酶鏈反應(yīng)：流聚合酶鏈反應(yīng):一種偽等溫PCR方法。將溶液置于熱梯度下，而不是反復(fù)加熱和冷卻聚合酶鏈反應(yīng)混合物。由此產(chǎn)生的熱不穩(wěn)定性驅(qū)動(dòng)對(duì)流流動(dòng)自動(dòng)將聚合酶鏈反應(yīng)試劑從熱區(qū)域和冷區(qū)域打亂，從而反復(fù)啟動(dòng)聚合酶鏈反應(yīng)。通過(guò)利用混沌流場(chǎng)的出現(xiàn)，可以優(yōu)化熱邊界條件和PCR外殼的幾何形狀等參數(shù)，以產(chǎn)生特異和快速的PCR。這種對(duì)流聚合酶鏈反應(yīng)設(shè)置明顯降低了設(shè)備功率需求和操作時(shí)間。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)):用于從RNA中擴(kuò)增DNA。逆轉(zhuǎn)錄酶將核糖核酸逆轉(zhuǎn)錄成cDNA ，然后通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)較廣用于表達(dá)譜，以確定基因的表達(dá)或鑒定RNA轉(zhuǎn)錄物的序列，包括轉(zhuǎn)錄起始和...