冷凍電鏡技術(shù)之冷凍蝕刻電子顯微鏡：冷凍蝕刻電鏡技術(shù)是從50年代開(kāi)始發(fā)展起來(lái)的一種將斷裂和復(fù)型相結(jié)合的制備透射電鏡樣品技術(shù)，亦稱(chēng)冷凍斷裂或冷凍復(fù)型，用于細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域的顯微結(jié)構(gòu)研究。冷凍蝕刻電鏡的優(yōu)點(diǎn)：①樣品通過(guò)冷凍，可使其微細(xì)結(jié)構(gòu)接近于活的狀態(tài);②樣品經(jīng)冷凍...

冷凍電子顯微鏡技術(shù)步驟之樣品制備：用于冷凍電鏡研究的生物樣品必須非常純凈。生物樣品是在高真空的條件下成像的，所以樣品的制備既要能夠保持本身的結(jié)構(gòu)又能抗脫水、電子輻射?，F(xiàn)在普遍采用的方法是通過(guò)快速冷凍使含水樣品中的水處于玻璃態(tài)，也就是在親水的支持膜上將含水樣品包...

冷凍電鏡技術(shù)基本原理之電鏡三維重構(gòu)理論：D.DeRosier和A.Klug提出三維重構(gòu)理論是借助一系列沿不同方向投影的電子顯微像來(lái)重構(gòu)被測(cè)物體的立體構(gòu)型，利用計(jì)算機(jī)數(shù)字圖像處理技術(shù)進(jìn)行電子顯微像三維重構(gòu)測(cè)定生物大分子結(jié)構(gòu)的概念和方法。透射電子顯微鏡成像過(guò)程中，...

冷凍電鏡技術(shù)解析結(jié)構(gòu)主要風(fēng)險(xiǎn)在：A.樣品很不穩(wěn)定，樣品寄送過(guò)來(lái)的時(shí)候，已經(jīng)降解或者聚集，無(wú)法進(jìn)行后續(xù)處理；B.樣品在冷凍制樣的過(guò)程中，可能會(huì)被凍碎，從而無(wú)法進(jìn)行后續(xù)處理；C.樣品純度可能很好，但是均一度很差，從而難以獲得樣品的高分辨結(jié)構(gòu)；D.我們關(guān)心的區(qū)域可能...

冷凍電鏡技術(shù)基本原理之三維冷凍電鏡技術(shù)：樣品經(jīng)過(guò)在液氮中的冷凍固定，使得生物大分子中的H2O分子以玻璃態(tài)的形式存在，保持低溫，將樣品放入顯微鏡，高度相干的電子作為光源從上面照射下來(lái)，透過(guò)樣品和附近的冰層，受到散射，利用探測(cè)器和透鏡系統(tǒng)把散射的信號(hào)成像記錄下來(lái)，...

冷凍電鏡技術(shù)：隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步和人類(lèi)對(duì)于生命科學(xué)領(lǐng)域知識(shí)的不斷積累，藥物研發(fā)越來(lái)越走向理性化，包括法規(guī)體系的建立和優(yōu)化、藥品質(zhì)量控制模式的變遷走向QbD階段?；诮Y(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)已經(jīng)逐漸成為藥物開(kāi)發(fā)設(shè)計(jì)的主流，與此同時(shí)冷凍電鏡技術(shù)也在蓬勃發(fā)展。冷凍電鏡單顆粒分...

低溫透射電鏡技術(shù)的應(yīng)用：膠束體系對(duì)于濃度、pH、添加劑種類(lèi)等液相環(huán)境條件的變化非常敏感，如果是干燥狀態(tài)其結(jié)構(gòu)與有液相完全不同，因此必須用低溫透射電鏡表征其結(jié)構(gòu)。通常情況下，膠束有球狀、囊泡狀、棒狀、層狀、六角束狀、洋蔥狀、蠕蟲(chóng)狀等多種形狀，應(yīng)用低溫透射電鏡技術(shù)...

冷凍電鏡技術(shù)揭示生物分子細(xì)節(jié)：冷凍電鏡可以通過(guò)揭示細(xì)胞里發(fā)生的生命過(guò)程細(xì)節(jié)，幫助人們了解很多有意思的生物學(xué)現(xiàn)象。比如，我們吃辣椒會(huì)覺(jué)得辣，是因?yàn)槔苯防镉幸环N叫做辣椒素的小分子。辣椒素與位于舌頭神經(jīng)末梢的膜蛋白TPRV1結(jié)合，打開(kāi)膜蛋白上的一個(gè)通道，讓細(xì)胞膜外面...

冷凍電鏡技術(shù)原理之電子斷層掃描成像技術(shù)：通過(guò)在顯微鏡內(nèi)傾轉(zhuǎn)樣品從而收集樣品多角度的電子顯微圖像并對(duì)這些電子顯微圖像根據(jù)傾轉(zhuǎn)幾何關(guān)系進(jìn)行重構(gòu)的方法稱(chēng)為電子斷層掃描成像技術(shù)。該方法主要應(yīng)用于細(xì)胞及亞細(xì)胞器，以及沒(méi)有固定結(jié)構(gòu)的生物大分子復(fù)合物(分子量范圍為800kD...

冷凍電子顯微鏡技術(shù)步驟之圖像采集：冷凍的樣品通過(guò)專(zhuān)門(mén)的設(shè)備一冷凍輸送器轉(zhuǎn)移到電鏡的樣品室。在照相之前，必須觀(guān)察樣品中的水是否處于玻璃態(tài)，如果不是則應(yīng)重新制備樣品。由于生物樣品對(duì)高能電子的輻射敏感，照相時(shí)必須使用較小曝光技術(shù)。經(jīng)過(guò)透射電子顯微鏡中一系列復(fù)雜的過(guò)程...

冷凍電鏡技術(shù)的原理：冷凍電子顯微學(xué)解析生物大分子及細(xì)胞結(jié)構(gòu)的中心是透射電鏡成像，其基本過(guò)程包括樣品制備、透射電鏡成像、圖像處理及結(jié)構(gòu)解析等幾個(gè)基本步驟。在透射電鏡成像中，電子槍產(chǎn)生的電子在高壓電場(chǎng)中被加速至亞光速并在高真空的顯微鏡內(nèi)部運(yùn)動(dòng)，根據(jù)高速運(yùn)動(dòng)的電子在...

冷凍電鏡技術(shù)原理之電子斷層掃描成像技術(shù)：通過(guò)在顯微鏡內(nèi)傾轉(zhuǎn)樣品從而收集樣品多角度的電子顯微圖像并對(duì)這些電子顯微圖像根據(jù)傾轉(zhuǎn)幾何關(guān)系進(jìn)行重構(gòu)的方法稱(chēng)為電子斷層掃描成像技術(shù)。該方法主要應(yīng)用于細(xì)胞及亞細(xì)胞器，以及沒(méi)有固定結(jié)構(gòu)的生物大分子復(fù)合物(分子量范圍為800kD...

冷凍電鏡技術(shù)的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)：1、更接近天然狀態(tài)：電子斷層成像技術(shù)則可用來(lái)研究一定厚度的亞細(xì)胞器在天然狀態(tài)下的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，不需要蛋白質(zhì)結(jié)晶。2、適用研究對(duì)象普遍：冷凍電鏡單粒子法既可以對(duì)具有對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)的大分子進(jìn)行研究，也適合于研究結(jié)構(gòu)不規(guī)則的大分子復(fù)合物，對(duì)于分子量的上...

冷凍電鏡技術(shù)的儀器結(jié)構(gòu)：冷凍電子顯微鏡的儀器結(jié)構(gòu)與透射電子顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)相似，只是在進(jìn)樣之前搭載了液態(tài)乙烷罐與冷凍倉(cāng)，保證在樣品快速冷凍后能夠即刻轉(zhuǎn)移至樣品倉(cāng)內(nèi)。冷凍室：在實(shí)際操作中，向液態(tài)乙烷中投入樣品時(shí)，乙烷會(huì)在樣品周?chē)焖俜序v，形成絕緣氣態(tài)膜，減慢向低...

冷凍電鏡技術(shù)之冷凍透射電鏡：冷凍透射電鏡(Cryo-TEM)通常是在普通透射電鏡上加裝樣品冷凍設(shè)備，將樣品冷卻到液氮溫度(77K)，用于觀(guān)測(cè)蛋白、生物切片等對(duì)溫度敏感的樣品。通過(guò)對(duì)樣品的冷凍，可以降低電子束對(duì)樣品的損傷，減小樣品的形變，從而得到更加真實(shí)的樣品形...

冷凍電鏡技術(shù)的原理：冷凍電子顯微學(xué)解析生物大分子及細(xì)胞結(jié)構(gòu)的中心是透射電鏡成像，其基本過(guò)程包括樣品制備、透射電鏡成像、圖像處理及結(jié)構(gòu)解析等幾個(gè)基本步驟。在透射電鏡成像中，電子槍產(chǎn)生的電子在高壓電場(chǎng)中被加速至亞光速并在高真空的顯微鏡內(nèi)部運(yùn)動(dòng)，根據(jù)高速運(yùn)動(dòng)的電子在...

冷凍電鏡技術(shù)揭示生物分子細(xì)節(jié)：科學(xué)家在透射電子顯微鏡之上發(fā)明了冷凍電鏡，實(shí)現(xiàn)了生物分子“近原子級(jí)”的分辨率，讓人類(lèi)終于可以一窺究竟生物分子是如何執(zhí)行其功能。在過(guò)去幾年里，冷凍電子顯微鏡技術(shù)逐漸成為結(jié)構(gòu)生物學(xué)的重要研究工具。冷凍電鏡技術(shù)的基本原理是將生物大分子溶...

冷凍電子顯微鏡技術(shù)步驟之圖像采集：冷凍的樣品通過(guò)專(zhuān)門(mén)的設(shè)備一冷凍輸送器轉(zhuǎn)移到電鏡的樣品室。在照相之前，必須觀(guān)察樣品中的水是否處于玻璃態(tài)，如果不是則應(yīng)重新制備樣品。由于生物樣品對(duì)高能電子的輻射敏感，照相時(shí)必須使用較小曝光技術(shù)。經(jīng)過(guò)透射電子顯微鏡中一系列復(fù)雜的過(guò)程...

冷凍電鏡技術(shù)是在20世紀(jì)70年代提出的，早在20世紀(jì)70年代科學(xué)家們就利用冷凍電鏡研究病毒分子的結(jié)構(gòu)，頭次提出了冷凍電鏡技術(shù)的原理、方法以及流程的概念。冷凍電鏡的發(fā)展：冷凍電鏡到底是什么?從上世紀(jì)70年代興起至今，冷凍電子顯微技術(shù)(cryo-EM)已經(jīng)跨越了4...

冷凍電鏡技術(shù)測(cè)定結(jié)構(gòu)的幾種方法：X射線(xiàn)晶體學(xué)、NMR、和冷凍電鏡技術(shù)各有優(yōu)缺點(diǎn)，將這幾種方法結(jié)合共同研究結(jié)構(gòu)與功能將使結(jié)構(gòu)生物學(xué)家對(duì)所研究的分子有更為全部的理解，而這些信息是單用任何一個(gè)方法所無(wú)法獲得的。將X射線(xiàn)晶體模型與經(jīng)電鏡獲得的密度圖重合可以對(duì)電鏡三維重...

冷凍電鏡技術(shù)是在20世紀(jì)70年代提出的，早在20世紀(jì)70年代科學(xué)家們就利用冷凍電鏡研究病毒分子的結(jié)構(gòu)，頭次提出了冷凍電鏡技術(shù)的原理、方法以及流程的概念。冷凍電鏡的發(fā)展：冷凍電鏡到底是什么?從上世紀(jì)70年代興起至今，冷凍電子顯微技術(shù)(cryo-EM)已經(jīng)跨越了4...

冷凍電鏡技術(shù)近年來(lái)獲得了迅猛的發(fā)展，取得了許多具有重大意義的成果。冷凍電鏡將生物分子進(jìn)行冷凍便可進(jìn)行高分辨率成像，還具有分辨率高、更接近天然狀態(tài)、適用研究對(duì)象普遍等優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，系統(tǒng)地綜述了冷凍電鏡技術(shù)在科學(xué)研究中的應(yīng)用，并展望冷凍電鏡技術(shù)未來(lái)的發(fā)展。冷凍電鏡（...

單顆粒冷凍電鏡技術(shù)的圖像處理技術(shù)：經(jīng)過(guò)多年的發(fā)展，目前冷凍電鏡的數(shù)據(jù)處理部分主要包含了以下的流程：(1)襯度傳遞函數(shù)的修正(CTFcorrection)；(2)樣品分子投影數(shù)據(jù)的篩選(particleselection)；(3)二維投影數(shù)據(jù)的分類(lèi)和降噪(2Da...

冷凍電鏡技術(shù)具有分辨率高、更接近天然狀態(tài)、適用研究對(duì)象普遍等特點(diǎn)，越來(lái)越多的科學(xué)家開(kāi)始把冷凍電鏡技術(shù)作為研究的一個(gè)新方向。冷凍電鏡技術(shù)與X射線(xiàn)技術(shù)和核磁共振技術(shù)互相補(bǔ)充，讓絕大多數(shù)的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)都可以被解析。眾多領(lǐng)域的研究者們將在未來(lái)冷凍電鏡新的技術(shù)方法的開(kāi)發(fā)...

冷凍電鏡技術(shù)之冷凍掃描電鏡：掃描電鏡工作者都面臨著一個(gè)不能回避的事實(shí)，就是所有生命科學(xué)以及許多材料科學(xué)的樣品都含有液體成分。很多動(dòng)植物組織的含水量達(dá)到98%，這是掃描電鏡工作者比較難對(duì)付的樣品問(wèn)題。冷凍掃描電鏡(Cryo-SEM)技術(shù)是克服樣品含水問(wèn)題的一個(gè)快...

冷凍電子顯微技術(shù)學(xué)解析生物大分子及細(xì)胞結(jié)構(gòu)的中心是透射電子顯微鏡成像,包括樣品制備、圖像采集、圖像處理及三維重構(gòu)等幾個(gè)基本步驟。三維重構(gòu)：數(shù)據(jù)處理的較終目的是為了獲得生物樣品的三維質(zhì)量密度圖，由二維圖像推知三維結(jié)構(gòu)的方法即三維重構(gòu)。其理論原理是在1968年由D...

冷凍電鏡技術(shù)原理之單顆粒技術(shù)：對(duì)分散分布的生物大分子分別成像，基于分子結(jié)構(gòu)同一性的假設(shè)，對(duì)多個(gè)圖像進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并通過(guò)對(duì)正、加和平均等圖像操作手段提高信噪比，進(jìn)一步確認(rèn)二維圖像之間的空間投影關(guān)系后經(jīng)過(guò)三維重構(gòu)獲得生物大分子的三維結(jié)構(gòu)方法。其適合的樣品分子量范圍...

單顆粒冷凍電鏡技術(shù)二維圖像分析——顆粒圖像的匹配與分類(lèi)：二維顆粒圖像的分類(lèi)是獲取三維結(jié)構(gòu)過(guò)程的第一步。對(duì)二維圖像的分析包括兩部分：顆粒圖像的匹配和顆粒圖像的分類(lèi)。匹配的過(guò)程通常會(huì)對(duì)顆粒圖像應(yīng)用一些變換操作，通過(guò)關(guān)聯(lián)函數(shù)去判斷不同顆粒圖像之間的相似程度。圖像匹配...

冷凍電鏡技術(shù)的儀器結(jié)構(gòu)：冷凍電子顯微鏡的儀器結(jié)構(gòu)與透射電子顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)相似，只是在進(jìn)樣之前搭載了液態(tài)乙烷罐與冷凍倉(cāng)，保證在樣品快速冷凍后能夠即刻轉(zhuǎn)移至樣品倉(cāng)內(nèi)。冷凍室：在實(shí)際操作中，向液態(tài)乙烷中投入樣品時(shí)，乙烷會(huì)在樣品周?chē)焖俜序v，形成絕緣氣態(tài)膜，減慢向低...

單顆粒冷凍電鏡技術(shù)的圖像處理技術(shù)：經(jīng)過(guò)多年的發(fā)展，目前冷凍電鏡的數(shù)據(jù)處理部分主要包含了以下的流程：(1)襯度傳遞函數(shù)的修正(CTFcorrection)；(2)樣品分子投影數(shù)據(jù)的篩選(particleselection)；(3)二維投影數(shù)據(jù)的分類(lèi)和降噪(2Da...