CK7免疫抗體

細(xì)胞的固定及免疫熒光：吸去一抗，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min。向孔內(nèi)滴加足夠量適宜濃度的二抗，37℃，室溫避光孵育1小時(shí)。注意二抗帶有熒光素標(biāo)記，因此操作過程盡量在暗處進(jìn)行。吸去二抗，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min。向玻片上滴加DAPI，或者Hoechst復(fù)染細(xì)胞核，一般為藍(lán)色熒光；避光孵育5-10min。使用PBS輕洗細(xì)胞3 次，每次 5 min，洗去多余的DAPI。取爬片時(shí)由于爬片與培養(yǎng)皿底結(jié)合較緊，張力較大，可將注射器針頭針尖向背面做個(gè)小鉤，這樣將爬片輕輕勾起，用小鑷子取出即可。用吸水紙吸干爬片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，注意將爬片反過來貼于多聚賴氨酸載玻片上，然后在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像，注意選擇抗體對應(yīng)的激發(fā)光源。早期的免疫熒光技術(shù)是將抗體與示蹤物質(zhì)結(jié)合，用于定位組織或細(xì)胞內(nèi)的抗原物質(zhì)。CK7免疫抗體

免疫熒光的制作：樣品準(zhǔn)備（貼壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞以及組織等）：對于貼壁細(xì)胞：先將潔凈的蓋玻片在70%乙醇中進(jìn)行浸泡處理，然后用干凈無菌的鑷子放置到培養(yǎng)皿中，用無菌PBS洗去殘留的乙醇。待細(xì)胞接近長成單層后取出蓋玻片，操作小心，防止細(xì)胞脫片。對于懸浮細(xì)胞：有2種方法，①先在懸浮液中進(jìn)行固定步驟，然后把細(xì)胞滴加在載玻片上，干燥后細(xì)胞會(huì)緊貼在載玻片上。②先在懸浮液中進(jìn)行固定和染色步驟，離心洗脫，然后用移液管移至盒式玻片進(jìn)行后續(xù)染色步驟。對于冷凍切片：切片放置在載玻片上后，可以直接進(jìn)行固定等后續(xù)操作。對于石蠟切片：免疫熒光中石蠟切片較少，要先進(jìn)行脫蠟和抗原修復(fù)處理。SIRT7免疫熒光熒光抗體技術(shù)具有高靈敏度和高特異性，可以實(shí)現(xiàn)精確的免疫檢測。

細(xì)胞的固定及免疫熒光：注意事項(xiàng)：（1）取細(xì)胞爬片時(shí)，動(dòng)作應(yīng)輕柔，防止將細(xì)胞爬片夾碎，影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)程。（2）種細(xì)胞過程中，要注意將細(xì)胞輕柔混勻，“八”字或者“十”字形搖晃，防止細(xì)胞局部生長過密。（3）稀釋、加二抗（熒光抗體）及此后的洗滌過程中注意避光。（4）細(xì)胞爬片進(jìn)行免疫熒光之后，需要盡快拍照，防止免疫熒光淬滅?；蛘叻庞诎岛袃?nèi)，暫時(shí)保存于4度冰箱，盡快拍照。（5）在進(jìn)行熒光顯微鏡拍照時(shí)，要根據(jù)熒光抗體選擇合適的激發(fā)光源。PI/DAPI能將凋亡和未凋亡的細(xì)胞都染成紅色/藍(lán)色，只在凋亡的細(xì)胞核中才有FITC-12-dUTP摻入而定位的綠色熒光。

免疫熒光-實(shí)驗(yàn)步驟：細(xì)胞爬片免疫熒光：在培養(yǎng)板中將已爬好細(xì)胞的玻片用PBS浸洗3次,每次5min;（圓蓋片：13mm24孔；18mm12孔；20mm6孔）用4%的多聚甲醛固定爬片15min,PBS浸洗玻片3次,每次5min0.5%TritonX-100(PBS配制)室溫通透20min(細(xì)胞膜上表達(dá)的抗原省略此步驟);PBS浸洗玻片3次,每次3min,吸水紙吸干PBS,在玻片上滴加3%的BSA（PBS配置）,室溫封閉30min5,吸水紙吸掉封閉液,不洗,每張玻片滴加足夠量用PBS稀釋好的一抗并放入濕盒,4℃孵育過夜。加熒光二抗:PBS浸洗爬片3次,每次5min,吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗,濕盒中室溫孵育50min。免疫熒光技術(shù)具有高靈敏度和高特異性，可以檢測非常低濃度的目標(biāo)分子。

熒光物質(zhì)，熒光色素：許多物質(zhì)都可產(chǎn)生熒光現(xiàn)象，但并非都可用作熒光色素。只有那些能產(chǎn)生明顯的熒光并能作為染料使用的有機(jī)化合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料。常用的熒光色素有：⑴異硫氰酸熒光素為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4，較大吸收光波長為490--495nm，較大發(fā)射光波長520--530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光，結(jié)構(gòu)式如下：有兩種同分異結(jié)構(gòu)，其中異構(gòu)體Ⅰ型在效率、穩(wěn)定性、與蛋白質(zhì)結(jié)合能力等方面都更好，在冷暗干燥處可保存多年，是應(yīng)用較普遍的熒光素。其主要優(yōu)點(diǎn)是：①人眼對黃綠色較為敏感，②通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色。⑵四乙基羅丹明為橘紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精。性質(zhì)穩(wěn)定，可長期保存。結(jié)構(gòu)式如下：較大吸收光波長為570nm，較大發(fā)射光波長為595～600nm，呈橘紅色熒光。⑶四甲基異硫氰酸羅丹明結(jié)構(gòu)式如下：較大吸引光波長為550nm，較大發(fā)射光波長為620nm，呈橙紅色熒光。與FITC的翠綠色熒光對比鮮明，可配合用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧?。其異硫氰基可與蛋白質(zhì)結(jié)合，但熒光效率較低。免疫熒光技術(shù)可以用于研究疾病的發(fā)生機(jī)制和醫(yī)治效果評估。VWF免疫熒光染色

免疫熒光技術(shù)可以用于研究心血管系統(tǒng)的疾病和醫(yī)治。CK7免疫抗體

細(xì)胞的固定及免疫熒光：1)吸除培養(yǎng)基，一般先加入PBS浸洗細(xì)胞 3 次，每次 5 min。2)向孔內(nèi)加入4%多聚甲醛1ml，進(jìn)行細(xì)胞固定，室溫固定20分鐘。3)吸去多聚甲醛，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min。4)向孔內(nèi)加入0.5%Triton X-100(PBS配制)室溫通透20min，目的是使細(xì)胞通透。5) 除去Triton X-100，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min。6)用10%的與二抗同源的山羊血清(PBS配制)或者5%BSA封閉2小時(shí)（選擇的封閉液與后面操作過程中抗體稀釋液一致）。封閉后不需要用PBS清洗。7)吸去封閉液，向每孔滴加足夠量適宜濃度的一抗（一次使用抗體可以根據(jù)抗體說明書推薦濃度，后續(xù)實(shí)驗(yàn)可以摸索抗體的適宜濃度），4℃濕盒內(nèi)孵育過夜。CK7免疫抗體