PDX-1免疫組化

熒光標記二抗的選擇普遍；與使用熒光素結(jié)合一抗的檢測相比，成本較低。間接免疫熒光的缺點：由于需要具有兩種不同物種反應(yīng)性的兩種抗體，因此物種交叉反應(yīng)性問題增加；與直接免疫熒光相比，時間更長（操作步驟更多）。間接免疫熒光的優(yōu)點：通過增加能夠與一抗結(jié)合的二抗數(shù)量進行信號放大；與直接免疫熒光相比，通過信號放大提高檢測靈敏度；熒光標記二抗的選擇普遍；與使用熒光素結(jié)合一抗的檢測相比，成本較低。間接免疫熒光的缺點：由于需要具有兩種不同物種反應(yīng)性的兩種抗體，因此物種交叉反應(yīng)性問題增加；與直接免疫熒光相比，時間更長（操作步驟更多）。免疫熒光技術(shù)可以用于研究環(huán)境污染和毒物作用。PDX-1免疫組化

熒光物質(zhì)，熒光色素：許多物質(zhì)都可產(chǎn)生熒光現(xiàn)象，但并非都可用作熒光色素。只有那些能產(chǎn)生明顯的熒光并能作為染料使用的有機化合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料。常用的熒光色素有：⑴異硫氰酸熒光素為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4，較大吸收光波長為490--495nm，較大發(fā)射光波長520--530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光，結(jié)構(gòu)式如下：有兩種同分異結(jié)構(gòu)，其中異構(gòu)體Ⅰ型在效率、穩(wěn)定性、與蛋白質(zhì)結(jié)合能力等方面都更好，在冷暗干燥處可保存多年，是應(yīng)用較普遍的熒光素。其主要優(yōu)點是：①人眼對黃綠色較為敏感，②通常切片標本中的綠色熒光少于紅色。⑵四乙基羅丹明為橘紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精。性質(zhì)穩(wěn)定，可長期保存。結(jié)構(gòu)式如下：較大吸收光波長為570nm，較大發(fā)射光波長為595～600nm，呈橘紅色熒光。⑶四甲基異硫氰酸羅丹明結(jié)構(gòu)式如下：較大吸引光波長為550nm，較大發(fā)射光波長為620nm，呈橙紅色熒光。與FITC的翠綠色熒光對比鮮明，可配合用于雙重標記或?qū)Ρ热旧Ｆ洚惲蚯杌膳c蛋白質(zhì)結(jié)合，但熒光效率較低。bcl-2免疫熒光染色免疫熒光技術(shù)可以用于研究細胞遷移和細胞黏附。

免疫熒光通過抗體與示蹤物質(zhì)結(jié)合，利用抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)，進而對抗原所在的細胞或組織進行定性或定量。由于熒光素所發(fā)的熒光可在熒光顯微鏡下檢出，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光，可以看見熒光所在的細胞或組織，利用定量技術(shù)測定含量，從而可對抗原進行細胞定性和定位分析。細胞免疫熒光用途：快速直觀顯示所檢測蛋白的細胞定位。材料與儀器：樣品：貼壁細胞；試劑：4% 組織固定液，PBS，Triton X-100，BSA，熒光二抗，免疫熒光染色二抗稀釋液，抗熒光猝滅封片液，0.25% 胰酶；器材：6/12/24 孔板，細胞爬片（蓋玻片），載玻片，15 ml 離心管。

免疫熒光檢測相對于酶檢測的優(yōu)勢：定量熒光信號的能力（與使用基于酶的方法進行的定性測定相反）；復(fù)用能力（可以結(jié)合不同發(fā)射光譜的熒光染料來檢測多種蛋白質(zhì)）；熒光染料的光穩(wěn)定性。免疫熒光技術(shù)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標記上熒光素，制成熒光抗體，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢測組織或細胞內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。在組織或細胞內(nèi)形成的抗原抗體復(fù)合物上含有標記的熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標本，熒光素受外來激發(fā)光的照射而發(fā)生明亮的熒光（黃綠色或橘紅色），可以看見熒光所在的組織細胞，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量技術(shù)測定含量。免疫熒光技術(shù)可以用于研究神經(jīng)系統(tǒng)的功能和疾病。

細胞和組織樣品處理：準備熒光標記的細胞樣品：為實現(xiàn)較佳的圖像質(zhì)量，首先應(yīng)建立針對目的蛋白和細胞結(jié)構(gòu)的研究，同時將其他一切背景等排除在圖像之外。固定和破膜細胞樣品用于標記–首先將細胞結(jié)構(gòu)、蛋白和核酸固定，然后使熒光染料和抗體滲入到細胞內(nèi)部，標記目的靶點。封閉細胞樣品，防止熒光標記物與研究無關(guān)的蛋白非特異性結(jié)合，較大限度提高信噪比。蛋白封閉液有助于減少非特異染色。抗體能夠取代封閉蛋白與其表位形成高親和力結(jié)合，而封閉液可防止樣品中的低親和力結(jié)合。免疫熒光技術(shù)可以用于研究肉瘤的發(fā)生和發(fā)展過程。bcl-2免疫熒光染色

熒光抗體法是利用熒光標記的抗體來追蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法。PDX-1免疫組化

細胞免疫熒光實驗注意事項：根據(jù)所檢測抗原所在位置來確認是否需要加入 Triton 進行通透。若所檢測抗原表位位于膜蛋白的白外段，則不需要通透；一般 5% BSA 封閉即可達到效果；從加熒光二抗起，后面所有操作步驟盡量避光?？s短在熒光顯微鏡下的觀察時間，1~2 h 為宜。染色后盡快熒光顯微鏡下觀察，若不能可放入 4 ℃ 冰箱避光保存一周。無/弱染色：烤片溫度過高，推薦 56~60 ℃ 1~2 h；一抗是否適用固定液和石蠟切片，使用濃度是否過低，孵育是否時間過短等。PDX-1免疫組化