CD36免疫檢測(cè)

來源: 發(fā)布時(shí)間:2024-01-10

免疫熒光間接法測(cè)抗體實(shí)驗(yàn)步驟:滴加0.01mol/L,pH7.4的PBS于已知抗原標(biāo)本片,10min后棄去,使標(biāo)本片保持一定濕度。滴加以0.01mol/L,pH7.4的PBS適當(dāng)稀釋的待檢抗體標(biāo)本,覆蓋已知抗原標(biāo)本片。將玻片置于有蓋搪瓷盒內(nèi),37℃保溫30min。取出玻片,置于玻片架上,先用0.01mol/L,pH7.4的PBS沖洗1-2次,然后按順序過0.01mol/L,pH7.4的PBS三缸浸泡,每缸5min,不時(shí)振蕩。取出玻片,用濾紙吸去多余水分,但不使標(biāo)本干燥,滴加一滴一定稀釋度的熒光標(biāo)記的抗人球蛋白抗體。將玻片平放在有蓋搪瓷盒內(nèi),37℃保溫30min。重復(fù)操作3。取出玻片,用濾紙吸去多余水分,滴加一滴緩沖甘油,再覆以蓋玻片。熒光顯微鏡高倍視野下觀察,結(jié)果判定同直接法。免疫熒光技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)研究中具有普遍的應(yīng)用前景。CD36免疫檢測(cè)

CD36免疫檢測(cè),免疫

直接免疫熒光:?jiǎn)慰贵w(一抗)用于免疫染色和檢測(cè)目標(biāo)蛋白。熒光素結(jié)合的一抗直接與目標(biāo)抗原結(jié)合,并使用成像顯微鏡觀察。直接免疫熒光的優(yōu)點(diǎn):由于無需為兩種抗體選擇不同的物種反應(yīng)性,從而降低了物種交叉反應(yīng)性問題。與間接免疫熒光相比,時(shí)間縮短(操作步驟減少)。直接免疫熒光的缺點(diǎn):不允許通過二抗進(jìn)行信號(hào)放大;檢測(cè)靈敏度降低;熒光素結(jié)合一抗的選擇有限;與使用熒光二抗的檢測(cè)相比,更昂貴。間接免疫熒光:使用兩種抗體(一抗和二抗)進(jìn)行免疫染色并檢測(cè)目標(biāo)蛋白。首先,用特異性一抗標(biāo)記目標(biāo)蛋白。然后,熒光素結(jié)合的二抗(與一抗具有不同的物種反應(yīng)性)識(shí)別結(jié)合的抗原-抗體復(fù)合物并與一抗結(jié)合。由于一個(gè)以上的二抗可以與一抗結(jié)合,熒光信號(hào)被放大,提供了更高的檢測(cè)靈敏度。CK7免疫熒光染色使用已知熒光抗原標(biāo)記物質(zhì)來檢查相應(yīng)抗體的方法被稱為熒光抗原技術(shù)。

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免疫熒光實(shí)驗(yàn)步驟:1.樣本準(zhǔn)備:細(xì)胞或薄組織。對(duì)單層生長(zhǎng)細(xì)胞,在傳代培養(yǎng)時(shí),將細(xì)胞接種到預(yù)先放置有處理過的蓋玻片的培養(yǎng)皿中,待細(xì)胞接近長(zhǎng)成單層后取出蓋玻片,PBS洗兩次;對(duì)懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)細(xì)胞,用PBS離心洗滌(1000rpm,5min)2次,用細(xì)胞離心甩片機(jī)制備細(xì)胞片或直接制備細(xì)胞涂片。2.固定:取適當(dāng)?shù)墓潭▌┕潭颖?。一般?%PFA固定4℃過夜。固定完畢后的樣本可置于含疊氮納的PBS中4℃保存3個(gè)月。3.洗滌:PBS洗滌5min*3次。4.打孔:選擇合適的通透劑處理樣本,目的是使抗體更容易進(jìn)入細(xì)胞與抗原結(jié)合。

免疫熒光的制作:樣品準(zhǔn)備(貼壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞以及組織等):對(duì)于貼壁細(xì)胞:先將潔凈的蓋玻片在70%乙醇中進(jìn)行浸泡處理,然后用干凈無菌的鑷子放置到培養(yǎng)皿中,用無菌PBS洗去殘留的乙醇。待細(xì)胞接近長(zhǎng)成單層后取出蓋玻片,操作小心,防止細(xì)胞脫片。對(duì)于懸浮細(xì)胞:有2種方法,①先在懸浮液中進(jìn)行固定步驟,然后把細(xì)胞滴加在載玻片上,干燥后細(xì)胞會(huì)緊貼在載玻片上。②先在懸浮液中進(jìn)行固定和染色步驟,離心洗脫,然后用移液管移至盒式玻片進(jìn)行后續(xù)染色步驟。對(duì)于冷凍切片:切片放置在載玻片上后,可以直接進(jìn)行固定等后續(xù)操作。對(duì)于石蠟切片:免疫熒光中石蠟切片較少,要先進(jìn)行脫蠟和抗原修復(fù)處理。免疫熒光技術(shù)可以用于研究神經(jīng)系統(tǒng)的功能和疾病。

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熒光物質(zhì),熒光色素:許多物質(zhì)都可產(chǎn)生熒光現(xiàn)象,但并非都可用作熒光色素。只有那些能產(chǎn)生明顯的熒光并能作為染料使用的有機(jī)化合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料。常用的熒光色素有:⑴異硫氰酸熒光素為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末,易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4,較大吸收光波長(zhǎng)為490--495nm,較大發(fā)射光波長(zhǎng)520--530nm,呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光,結(jié)構(gòu)式如下:有兩種同分異結(jié)構(gòu),其中異構(gòu)體Ⅰ型在效率、穩(wěn)定性、與蛋白質(zhì)結(jié)合能力等方面都更好,在冷暗干燥處可保存多年,是應(yīng)用較普遍的熒光素。其主要優(yōu)點(diǎn)是:①人眼對(duì)黃綠色較為敏感,②通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色。⑵四乙基羅丹明為橘紅色粉末,不溶于水,易溶于酒精。性質(zhì)穩(wěn)定,可長(zhǎng)期保存。結(jié)構(gòu)式如下:較大吸收光波長(zhǎng)為570nm,較大發(fā)射光波長(zhǎng)為595~600nm,呈橘紅色熒光。⑶四甲基異硫氰酸羅丹明結(jié)構(gòu)式如下:較大吸引光波長(zhǎng)為550nm,較大發(fā)射光波長(zhǎng)為620nm,呈橙紅色熒光。與FITC的翠綠色熒光對(duì)比鮮明,可配合用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧?。其異硫氰基可與蛋白質(zhì)結(jié)合,但熒光效率較低。免疫熒光技術(shù)可以用于研究動(dòng)物模型和藥物篩選。CK7免疫熒光染色

免疫熒光技術(shù)可以用于研究藥物的靶點(diǎn)和作用機(jī)制。CD36免疫檢測(cè)

免疫熒光實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng):為了保證熒光染色的正確性,初次試驗(yàn)時(shí)需設(shè)置下述對(duì)照,以排除某些非特異性熒光染色的干擾。①標(biāo)本自發(fā)熒光對(duì)照:標(biāo)本加1-2滴0.01mol/L,pH7.4的PBS。②特異性對(duì)照(抑制試驗(yàn)):標(biāo)本加未標(biāo)記的特異性抗體,再加熒光標(biāo)記的特異性抗體。③陽(yáng)性對(duì)照:已知的陽(yáng)性標(biāo)本加熒光標(biāo)記的特異性抗體。如果標(biāo)本自發(fā)熒光對(duì)照和特異性對(duì)照呈無熒光或弱熒光,陽(yáng)性對(duì)照和待檢標(biāo)本呈強(qiáng)熒光,則為特異性陽(yáng)性染色。一般標(biāo)本在高壓汞燈下照射超過3min,就有熒光減弱現(xiàn)象,經(jīng)熒光染色的標(biāo)本較好在當(dāng)天觀察,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),熒光強(qiáng)度會(huì)逐漸下降。CD36免疫檢測(cè)