外泌體的工作原理

結(jié)果表明，PS親和法可以檢測到許多目前為止都無法檢測的外泌體蛋白質(zhì)和RNA。應(yīng)用Tim4的外泌體強結(jié)合能力，可用ELISA或FACS高靈敏度定性檢測、定量分析外泌體。以前無法用超速離心法提取的微囊泡，也通過運用PS親和法實現(xiàn)高純度提取。本指導書中對該技術(shù)進行詳細說明，這項技術(shù)的有用性今后將受到世界各方評價，有望在外泌體和微囊泡生理功能的分析研究上起重大貢獻。外泌體的檢測和提取還遇到一個困難即：對各種外泌體的分類。研究人員尚未統(tǒng)一定義以何種方法提取的細胞外囊泡可以稱之為外泌體，給實驗數(shù)據(jù)的分析和重復性確認帶來困難。近年，隨著國際細胞外囊泡協(xié)會的成立、世界性研究者研討會的舉辦，提案MISEV指南作為國際標準，計劃或已經(jīng)開始進行EV研究的科學家請務(wù)必閱讀這些方針。超速離心是從生物體液或細胞上清分離外泌體的金標準方法。外泌體的工作原理

流式細胞技術(shù)針對外泌體的表面抗原標記物進行檢測，能夠?qū)崿F(xiàn)外泌體的高通量、多通道分析。但是由于外泌體的粒徑小、折射率低，所以采用常規(guī)的流式細胞儀進行檢測時往往需要將外泌體與beads連接以增大表面積、增強反射，操作耗時又費力。Tian等搭建了一種高靈敏度的流式細胞儀(HSFCM)，將可檢測的外泌體粒徑降至40nm，能夠在不連接beads的情況下實現(xiàn)每分鐘10000個外泌體的檢測，并且能夠結(jié)合免疫熒光的方法進行外泌體標志蛋白質(zhì)的定量檢測，目前該儀器已商品化。外泌體打了3次還是會長痘有報導指出，外泌體內(nèi)miRNA參與促進血管新生、抗癥性和促進膠原蛋白沉淀等一系列過程。

雖然系統(tǒng)遞送的外泌體主要在肝臟、腎臟和脾臟中積累，但通過在外泌體的外表面上展示特定的靶向分子。例如，識別靶抗原的肽或抗體片段，可以獲得靶向外泌體；通過在細胞分泌囊泡上展示糖基磷脂酰肌醇（GPI）錨定的納米抗體，可以使細胞分泌囊泡顯示多種蛋白，包括抗體、熒光蛋白和信號分子。自然分泌的外泌體分離純化直接作為藥物的潛力有限，但是，將自然的外泌體分泌所需組分摻入合成脂質(zhì)體或納米顆粒中，并且使用可控程序組裝后的工程化外泌體模擬物在藥學上擁有更大的應(yīng)用潛力。

Vlassov等人發(fā)表的一篇外泌體的提取方法及組成的專利文獻中介紹，通過終濃度為8%的PEG6000與生物體液共孵育14h后，10000xg離心1h，可將直徑在30-150nm之間，且包含豐富RNA的外泌體沉淀下來。因此采用終濃度為8%的PEG6000沉淀血清中的外泌體，為了進一步純化胎盤相關(guān)外泌體，將獲得的包含外泌體的沉淀用PBS重新懸浮后，加入非線性蔗糖密度梯度層，10000xg超速離心5h，將分層液采用PEG6000進行2次沉淀。經(jīng)過多次實驗反復驗證，確定同時表達外泌體標志蛋白分子及胎盤特異性蛋白分子的胎盤來源外泌體所在密度層。外泌體作為核酸分子的藥物載體主要用于基因治理。

外泌體是由細胞細胞質(zhì)內(nèi)的晚期內(nèi)泡小體以膜融合的方式通過胞吐方式主動分泌到細胞外環(huán)境的一種直徑30-100nm的微型囊泡，其形態(tài)規(guī)則，呈圓形或橢圓形杯狀結(jié)構(gòu)，不同類型細胞分泌的外泌體具有很多共性，包括膜上富含脂筏及豐富的跨膜蛋白，如四次跨膜蛋白家族成員CD63、CD81等，表面為類似于細胞膜的脂質(zhì)雙分子層，具有一定的疏水性。外泌體能夠攜帶微小RNA(microRNAs,miRNAs)、RNA、蛋白質(zhì)等生物活性分子，并在細胞外環(huán)境穩(wěn)定存在，而且通過傳遞供體細胞信息，調(diào)節(jié)靶細胞的代謝通路。外泌體可由多種類型細胞分泌，妊娠期母體血清中存在表達胎盤堿性磷酸酶（placentalalkalinephosphatase,）的胎盤來源外泌體，并且在妊娠中發(fā)揮重要的作用。外泌體的異質(zhì)性可以根據(jù)其大小、含量(載物)、對受體細胞的功能影響以及細胞來源來區(qū)分。如何提取外泌體

外泌體的復雜性，為疾病檢測和監(jiān)測提供了一個多指標的診斷窗口。外泌體的工作原理

血清中的miR-122和miR-145非常不穩(wěn)定,將血清在4°C短期保存期間即發(fā)生降解,這可能是由外泌體的異質(zhì)性所導致的。–80°C保存被公認是保存各種生物標本如尿、牛奶、血液和支氣管肺泡灌洗液適宜的保存環(huán)境,雖然這樣保存血漿可能產(chǎn)生含有大量“污染物”的外泌體。4°C保存雖然容易導致外泌體中蛋白和核酸的損失,但卻能夠避免凍融過程造成的囊泡破壞。外泌體雖然建議保存于-80°C環(huán)境下,但在處理或運輸過程中有時很難維持這種低溫條件。CHAROENVIRIYAKUL等提出一種凍干法以保存外泌體,在冷凍過程中使用海藻糖作為保護劑,海藻糖可以提供生物保護作用,如穩(wěn)定蛋白質(zhì)、細胞膜和脂質(zhì)體;減少冷凍過程中冰的形成;防止蛋白質(zhì)以及外泌體的聚集;減少分離和保存過程中細胞外囊泡的損失等。外泌體的工作原理

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