外泌體表征方法

常規(guī)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中，實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)（RT-PCR）普遍用于microRNA的檢測(cè)實(shí)踐中，但外泌體樣品中的microRNA豐度極低，普通RT-PCR技術(shù)的靈敏度已經(jīng)不能夠滿足。第三代微滴式數(shù)字PCR——ddPCR技術(shù)，成為外泌體microRNA檢測(cè)的選擇技術(shù)。微滴式數(shù)字PCR（DropletdigitalPCR），又成為“油包水PCR”，在傳統(tǒng)的PCR擴(kuò)增前對(duì)樣品進(jìn)行微滴化處理，即將含有核酸分子的反應(yīng)體系分成成千上萬個(gè)納升級(jí)的微滴，其中每個(gè)微滴或不含待檢核酸靶分子，或者含有一個(gè)至數(shù)個(gè)待檢核酸靶分子。經(jīng)PCR擴(kuò)增后，逐個(gè)對(duì)每個(gè)微滴進(jìn)行檢測(cè)，有熒光信號(hào)的微滴判讀為1，沒有熒光信號(hào)的微滴判讀為0，根據(jù)泊松分布原理及陽(yáng)性微滴的個(gè)數(shù)與比例即可得出靶分子的起始拷貝數(shù)或濃度。外泌體的膜蛋白有可能與細(xì)胞膜蛋白作用，活躍細(xì)胞內(nèi)通路。外泌體表征方法

外泌體的臨床應(yīng)用：間充質(zhì)干細(xì)胞是目前較普遍使用的細(xì)胞類型，它具有自我更新，多向分化、分泌細(xì)胞因子和細(xì)胞外囊泡體、免疫調(diào)節(jié)、來源普遍等特點(diǎn)，在流感病毒的臨床診療中取得了良好的成果。間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體與間充質(zhì)干細(xì)胞有著相似的功能，包括修復(fù)與再生組織、阻止炎癥反應(yīng)及調(diào)節(jié)機(jī)體免疫，但外泌體相對(duì)于間充質(zhì)干細(xì)胞又有許多優(yōu)勢(shì)。首先，間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體更穩(wěn)定，更好保存，易于管理和控制，可以人為改變其內(nèi)容物的種類和數(shù)量。其次，它們沒有活細(xì)胞，不會(huì)像間充質(zhì)干細(xì)胞那樣可能會(huì)過多增殖而放大療效或者病變導(dǎo)致疾病加重；另外，它有可能避免某些針對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的調(diào)控問題，間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體有代替間充質(zhì)干細(xì)胞的趨勢(shì)。外泌體的形成外泌體的提取的方式：過濾離心。

外泌體的相關(guān)成分：1、外泌體的膜同細(xì)胞一樣，是磷脂雙分子層。2、外泌體膜含有MHC-1/2蛋白，能綁定特異性的肽鏈。3、外泌體膜中有跨膜蛋白PGRL、LAMP1、LAMP2。4、外泌體膜中有膜轉(zhuǎn)運(yùn)融合蛋白annexins、RAN、GTPases。5、外泌體膜上有脂質(zhì)筏Chol、ceramide、SM、PC，限制膜流動(dòng)，參與包括跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、物質(zhì)內(nèi)吞、脂質(zhì)及蛋白定向分選的多種功能。6、外泌體中含有核酸，包括miRNA、DNA、lncRNA、mRNA；同時(shí)還有一些蛋白、脂類也能被包裹到外泌體中。7、與外泌體產(chǎn)生相關(guān)的重要分子：Ral、ARF6、PLD2、RAB家族。8、一些物質(zhì)進(jìn)行外泌體中是特異性的：如hnRNPA2B1能結(jié)合lncRNA或miRNA特異性的序列（GGAG/CCCU），進(jìn)行主動(dòng)包埋。外泌體的膜同細(xì)胞一樣，是磷脂雙分子層。

Exosome，中文名外泌體，是一種能被大多數(shù)細(xì)胞分泌的微小膜泡，具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)，直徑大約40-100nm。盡管外泌體較初在1983年就被發(fā)現(xiàn)，但人們一直認(rèn)為它只是一種細(xì)胞的廢棄物。然而較近幾年，人們發(fā)現(xiàn)這種微小膜泡中含有細(xì)胞特異的蛋白、脂質(zhì)和核酸，能作為信號(hào)分子傳遞給其他細(xì)胞從而改變其他細(xì)胞的功能。這些發(fā)現(xiàn)點(diǎn)燃了人們對(duì)細(xì)胞分泌膜泡的興趣。2015年，隨著精確醫(yī)學(xué)概念的提出，越來越多的人開始關(guān)注如何能做到疾病的精確診斷和診療。外泌體作為一個(gè)新型的研究熱點(diǎn)，由于它在體內(nèi)存在的普遍性和獲取的便捷性，已經(jīng)成為了疾病診斷診療的潛在有效方式，在精確醫(yī)學(xué)發(fā)展上有著光明的前景。外泌體是其中一類小囊泡，直徑為30~150nm，密度1.10~1.18g/ml。

NTA技術(shù)已被作為外泌體表征手段之一，相較于其他表征方式NTA技術(shù)的樣本處理更簡(jiǎn)單、更能保證外泌體原始狀態(tài)、檢測(cè)速度更快。大致方法是：將分離的外泌體樣本注入納米顆粒追蹤分析儀，用激光光束穿過樣本，激光在腔室內(nèi)與顆粒相互作用時(shí)會(huì)發(fā)生散射，通過裝有攝像頭的顯微鏡收集散射光，捕捉外泌體的布朗運(yùn)動(dòng)，實(shí)現(xiàn)顆粒可視化。然后使用Stokes-Einstein方程來測(cè)量粒子的平均速度，繼而估算粒子的大小。NTA能夠測(cè)量粒徑10-1000nm之間的顆粒，包含了外泌體50-150nm的徑粒范圍，但是NTA鑒定需要大于0.5毫升的樣品體積以及優(yōu)化的數(shù)據(jù)收集和分析參數(shù)，另外，NTA比較難區(qū)分與外泌體具有相似布朗運(yùn)動(dòng)的蛋白質(zhì)聚集體，因此無法排除其他物質(zhì)干擾。外泌體產(chǎn)生相關(guān)的重要分子：Ral、ARF6、PLD2、RAB家族。血清外泌體circRNA測(cè)序

外泌體可通過其攜帶的蛋白質(zhì)、核酸、脂類等來調(diào)節(jié)受體細(xì)胞的生物學(xué)活性。外泌體表征方法

外泌體的提取分離方法：1、PEG-base沉淀法：聚乙二醇可與疏水性蛋白和脂質(zhì)分子結(jié)合共沉淀，早先應(yīng)用于從血清等樣本中收集病毒，現(xiàn)在也被用來沉淀外泌體，其原理可能與競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合游離水分子有關(guān)。利用PEG沉淀外泌體存在不少問題：比如純度和回收率低，雜蛋白較多（假陽(yáng)性），顆粒大小不均一，產(chǎn)生難以去除的聚合物，機(jī)械力或者吐溫-20等化學(xué)添加物將會(huì)破壞外泌體等，因此發(fā)表文章時(shí)易受質(zhì)疑。2、試劑盒提?。航鼛啄陙?，市場(chǎng)上已出現(xiàn)各種商業(yè)化的外泌體提取試劑盒，有的是通過特殊設(shè)計(jì)的過濾器過濾掉雜質(zhì)成分，有的則采用空間排阻色譜法(SEC)進(jìn)行分離純化，也有的則利用化合物沉淀將法外泌體沉淀出來。外泌體表征方法

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