外泌體起源

外泌體研究背景：胞外囊泡是從細胞膜上脫落或者由細胞分泌的具有雙層膜結(jié)構的囊泡狀小體，主要由微囊泡、凋亡小體、外泌體組成。而外泌體是其中一類小囊泡，直徑為30~150nm，密度1.10~1.18g/ml，可攜帶核酸、蛋白質(zhì)質(zhì)和脂質(zhì)等，存在于血液、唾液、尿液等多種體液中。越來越多的研究證實，外泌體可以通過細胞間轉(zhuǎn)移核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等特定物質(zhì)，發(fā)揮特殊的功能。如在抗原提呈細胞中呈遞抗原程中、腫細胞細胞發(fā)生了發(fā)展、神經(jīng)細胞信號轉(zhuǎn)導過程中都發(fā)揮著重要作用。對外泌體的分析和檢測可以輔助疾病的早期診斷、療效評價和預后分析。外泌體可通過其攜帶的蛋白質(zhì)、核酸、脂類等來調(diào)節(jié)受體細胞的生物學活性。外泌體具有異質(zhì)性，即使是同一種細胞分泌的外泌體都有可能具有比較大功能區(qū)別。外泌體起源

外泌體分離的主要挑戰(zhàn)之一是消除納米級污染物，包括干擾外泌體標志物解析的游離核酸和脂蛋白。超速離心是目前分離外泌體的主要技術。盡管如此，它仍難以符合臨床應用所需的標準，主要是由于該方法得到的外泌體純度不足，產(chǎn)量較低，完整性欠佳且分離純化操作耗時長。其他方法，例如基于聚乙二醇（PEG）的沉淀，磷脂酰絲氨酸親和捕獲，尺寸排阻色譜法和膜親和捕獲，近年來已經(jīng)出現(xiàn)在特定的應用中，但是只適用于特定場景。近來，非對稱流場-流分離方法已被用于從細胞和瘤子培養(yǎng)基中高分辨率地分選EV亞群，但其通量受到繁瑣的樣品制備程序的影響。單一分析耗時的過程也限制了其普遍的應用。因此，目前亟需開發(fā)創(chuàng)新技術以提高外泌體分離純化的效率，純度，產(chǎn)量，速度和耐用性?；诔瑸V的技術提供了潛在的有前途的替代方法，但它們也有缺點。在切向流過濾中，使進料流平行于多孔膜流動，以避免堵塞。然而，盡管已實現(xiàn)使用切向流過濾從大量條件細胞培養(yǎng)基中濃縮外泌體，但受制于其一次性模塊的成本高，高剪切應力，難以處理小體積樣品等因素而難以應用于臨床分析。血漿外泌體circRNA測序超速離心法，這是目前外泌體提取較常用的方法。

外泌體的生物發(fā)生和鑒定。液體和細胞外成分，如蛋白質(zhì)、脂類、代謝物、小分子和離子，可以通過內(nèi)吞作用和質(zhì)膜內(nèi)陷，與細胞表面蛋白一起進入細胞。由此產(chǎn)生的胞腔側(cè)質(zhì)膜芽的形成表現(xiàn)為質(zhì)膜的外-內(nèi)取向。這一出芽過程導致芽的形成可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)、跨高爾基網(wǎng)絡(TGN)和線粒體預先形成的早期核內(nèi)體融合。ESEs也可以與ER和TGN融合，這可能解釋了內(nèi)吞物如何到達它們的。因此，一些ESEs可以包含膜和腔的成分，可以表示不同的起源。外泌體表面蛋白包括四聚體蛋白、整合蛋白、免疫調(diào)節(jié)蛋白等。外泌體可以包含不同類型的細胞表面蛋白、細胞內(nèi)蛋白、RNA、DNA、氨基酸和代謝物。

研究外泌體介導的microRNA的調(diào)控機制，第一步通過microRNA表達譜的檢測分析來源于肝病細胞的外泌體。第二步，應用肝細胞和外泌體共培養(yǎng)實驗得出以下結(jié)論：來源于肝病細胞的外泌體能促進肝病細胞的生長及遷移侵襲，且外泌體有運輸microRNA至受體細胞的功能。第三步，研究發(fā)現(xiàn)Vps4A是一個外泌體的重要調(diào)控因子，與肝病的發(fā)生有著密切的關系，Vps4A基因的表達下調(diào)肝病的發(fā)生及轉(zhuǎn)移相關。通過microRNA高通量測序發(fā)現(xiàn)Vps4A基因能導致外泌體分泌肝病相關的重要microRNA，與肝病的發(fā)生密切相關。1983年，外泌體初次于綿羊網(wǎng)織紅細胞中被發(fā)現(xiàn)。

外泌體的提取分離方法：1、PEG-base沉淀法：聚乙二醇可與疏水性蛋白和脂質(zhì)分子結(jié)合共沉淀，早先應用于從血清等樣本中收集病毒，現(xiàn)在也被用來沉淀外泌體，其原理可能與競爭性結(jié)合游離水分子有關。利用PEG沉淀外泌體存在不少問題：比如純度和回收率低，雜蛋白較多（假陽性），顆粒大小不均一，產(chǎn)生難以去除的聚合物，機械力或者吐溫-20等化學添加物將會破壞外泌體等，因此發(fā)表文章時易受質(zhì)疑。2、試劑盒提?。航鼛啄陙?，市場上已出現(xiàn)各種商業(yè)化的外泌體提取試劑盒，有的是通過特殊設計的過濾器過濾掉雜質(zhì)成分，有的則采用空間排阻色譜法(SEC)進行分離純化，也有的則利用化合物沉淀將法外泌體沉淀出來。需要開發(fā)大規(guī)模生產(chǎn)質(zhì)量可控的外泌體并快速純化外泌體的技術和策略。安徽干細胞外泌體

外泌體分離之后，需要經(jīng)過一系列鑒定才能確定分離的是外泌體。外泌體起源

ELISA與WB的原理一樣，在抗體包被的微孔板中加入待測樣品、封閉、一抗孵育，洗滌后加入酶標待測物形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，徹底洗滌后加顯色劑并用酶標儀測定吸光值，結(jié)尾用標準曲線計算外泌體表達量。ELISA能實現(xiàn)對外泌體特異性蛋白的定量。其他外泌體鑒定方法還有微流體測定法和外泌體蛋白質(zhì)組學分析等。由于外泌體在各種生命過程中的重要作用及其作為疾病生物標志物和藥物輸送系統(tǒng)的潛力，人們對此領域的興趣越來越高。盡管目前在技術上取得了長足的進步，但尚未建立對外泌體進行準確和標準化鑒定以及定量的方法，關于外泌體的量應由囊泡顆粒的數(shù)量、囊泡蛋白的量或囊泡數(shù)與蛋白之比來定義仍存在比較多爭論。建立外泌體分離、表征以及效價測定的標準化方法將是外泌體作為診斷和診療用途之前需要解決的問題。外泌體起源

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